神經(jīng)特異性轉(zhuǎn)錄因子、鈣整合素結(jié)合蛋白多克隆抗體的制備及多巴胺對星形膠質(zhì)細(xì)胞影響的初步研究.pdf

1、目的：制備兔抗人神經(jīng)特異性轉(zhuǎn)錄因子LMO3的多克隆抗體、鼠抗人鈣整合素結(jié)合蛋白CIB的多克隆抗體；觀察多巴胺對星形膠質(zhì)細(xì)胞增殖及鈣信號的影響. 方法：(1)將構(gòu)建好的原核表達載體pET32a-LMO3、pET32a-CIB，轉(zhuǎn)入大腸桿菌BL21(DE3)中，以IPTG誘導(dǎo)BL21(DE3)分別表達LMO3、CIB融合蛋白，以SDS-PAGE鑒定融合蛋白LMO3、CIB的表達。用含LMO3、CIB融合蛋白的聚丙烯酰胺凝膠顆粒為抗原

2、分別免疫兔及BALB/c/小鼠制備抗血清，抗血清經(jīng)protein-G親和層析后用酶聯(lián)免疫吸附試驗、Western blot及免疫組化檢測該抗體的特異性；(2)原代培養(yǎng)星形膠質(zhì)細(xì)胞，純化后以免疫組織化學(xué)方法鑒定，流式細(xì)胞儀檢測多巴胺對膠質(zhì)細(xì)胞細(xì)胞周期的影響，激光共聚焦顯微鏡檢測多巴胺對膠質(zhì)細(xì)胞胞內(nèi)游離鈣離子濃度的影響。 結(jié)果：(1)通過重組表達獲得LMO3、CIB抗原蛋白，分別免疫兔及小鼠并純化抗血清得到特異性的抗LMO3、CIB

3、多克隆抗體，制備的抗體不但能檢測外源性表達的重組蛋白并且能檢測細(xì)胞內(nèi)源性表達的蛋白；同時免疫組化的結(jié)果顯示，LMO3在SHG44膠質(zhì)瘤細(xì)胞株，星形膠質(zhì)細(xì)胞瘤、乳腺癌、結(jié)腸癌組織中定位于細(xì)胞質(zhì)，在少突膠質(zhì)細(xì)胞瘤組織中主要定位于細(xì)胞核中；CIB在SHG44膠質(zhì)瘤細(xì)胞株、Huh7肝癌細(xì)胞株，星形膠質(zhì)細(xì)胞瘤、乳腺癌、結(jié)腸癌組織中主要定位于細(xì)胞質(zhì)，在少突膠質(zhì)細(xì)胞瘤組織中定位于細(xì)胞核中。(2)原代培養(yǎng)星形膠質(zhì)細(xì)胞，純化后GFAP鑒定星形膠質(zhì)細(xì)胞比例