實(shí)驗(yàn)室誘導(dǎo)志賀菌屬耐喹諾酮類抗生素靶基因突變時(shí)序檢測(cè).pdf

1、背景和目的： 志賀菌屬細(xì)菌又稱痢疾桿菌，是感染性腹瀉的主要病原體之一。它所引起的細(xì)菌性痢疾是一種全球流行的急性腸道傳染病，在全世界年病例數(shù)超過(guò)2億，年死亡人數(shù)約60萬(wàn)人，其中2/3是兒童。盡管世界各國(guó)在菌痢防治上付出了巨大努力，但由于志賀菌菌型多、菌株易變遷、感染后免疫力不持久、型間無(wú)交叉免疫等等原因，在衛(wèi)生條件相對(duì)落后的發(fā)展中國(guó)家，菌痢仍難以預(yù)防；而在治療上，隨著現(xiàn)代醫(yī)學(xué)技術(shù)的發(fā)展，特別是近年來(lái)由于濫用抗菌藥物，志賀菌頻繁發(fā)生變

2、異產(chǎn)生耐藥株，且耐藥率高、耐藥產(chǎn)生速度快、耐藥范圍廣，不斷給細(xì)菌性痢疾的治療帶來(lái)新的挑戰(zhàn)。由此，細(xì)菌性痢疾的耐藥性問(wèn)題已成為臨床和流行病學(xué)菌痢防治上的重要課題。喹諾酮類抗生素是目前治療菌痢的主要藥物。上世紀(jì)80年代喹諾酮類藥物應(yīng)用于臨床，志賀菌屬細(xì)菌起初對(duì)其敏感性較高，達(dá)95﹪以上，菌痢的療效曾一度改觀。但近年來(lái)已發(fā)現(xiàn)敏感性降至85﹪以下。 鑒于菌痢在腸道傳染病防治工作中的重要地位及喹諾酮類藥物目前在臨床治療感染性腹瀉的重要性，

3、研究志賀菌屬細(xì)菌的耐藥性，尤其對(duì)喹諾酮類藥物的可能機(jī)制顯得十分必要。喹諾酮耐藥機(jī)制研究的最新成果顯示，細(xì)菌耐受喹諾酮類藥物的機(jī)制可能有以下四個(gè)方面：①靶基因突變，主要是編碼DNA促旋酶A亞基的基因gyrA和編碼拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅳ的C亞基的基因parC突變；②主動(dòng)外排系統(tǒng)；③細(xì)菌細(xì)胞膜通透性的改變；④質(zhì)粒介導(dǎo)的耐藥。其中前三種耐藥機(jī)制均為染色體突變介導(dǎo)的。目前認(rèn)為，靶基因突變?cè)诩?xì)菌對(duì)喹諾酮類耐藥中起重要作用，而另兩種機(jī)制是細(xì)菌產(chǎn)生包括喹諾酮在內(nèi)

4、的多重耐藥的主要機(jī)制。雖然到目前為止，對(duì)志賀菌屬細(xì)菌耐喹諾酮類藥物機(jī)制的研究，包括了臨床分離耐藥株和體外誘導(dǎo)耐藥突變株，而且對(duì)各種機(jī)制的研究都有所涉及，但是對(duì)各種機(jī)制在志賀菌屬細(xì)菌耐藥形成中各自的地位與相互關(guān)系尚需進(jìn)一步探明。為了解喹諾酮類各種耐藥機(jī)制在志賀菌屬細(xì)菌耐藥形成中各自的地位、作用特點(diǎn)與相互關(guān)系，本研究以藥物選擇性——基因突變——耐藥形成理論為出發(fā)點(diǎn)，采用人工誘導(dǎo)的方式，用氟喹諾酮類抗生素諾氟沙星對(duì)志賀菌敏感株進(jìn)行體外誘導(dǎo)，使

5、之逐步產(chǎn)生耐藥性，通過(guò)測(cè)定諾氟沙星、四環(huán)素、氯霉素、氨芐青霉素對(duì)各代菌株的最低抑菌濃度檢測(cè)耐藥程度的變化及多重耐藥性的獲得，并對(duì)各代菌株的gyrA基因和parC基因進(jìn)行N末端編碼區(qū)的聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)擴(kuò)增，運(yùn)用PCR-SSCP對(duì)其突變性進(jìn)行檢測(cè)，對(duì)檢測(cè)出的突變菌株進(jìn)行核酸序列分析，以明確靶基因突變位點(diǎn)及方向，探討耐藥程度與突變位點(diǎn)之間的關(guān)系，為指導(dǎo)臨床早期發(fā)現(xiàn)耐藥菌株的存在，合理、有效地應(yīng)用喹諾酮類抗生素，防止其耐藥性進(jìn)一步增加提供

6、依據(jù)，同時(shí)也為喹諾酮類新藥品種的開發(fā)提供一定依據(jù)。并用能量抑制劑碳酰氰間氯苯腙(Carbonyl cyanide m-chlorophenylhydrazone，CCCP)抑制主動(dòng)外排作用，觀察此過(guò)程中諾氟沙星對(duì)細(xì)菌最低抑菌濃度(MIC)的變化，探討主動(dòng)外排系統(tǒng)在志賀菌多重耐藥中的作用及其與靶基因突變機(jī)制在志賀菌屬細(xì)菌喹諾酮耐藥形成中的關(guān)系，為菌痢的防治提供理論依據(jù)和對(duì)策。 方法 1.菌株的復(fù)蘇與鑒定：對(duì)我教研室4℃冰箱

7、中以半固體穿刺法保存的48株志賀菌在LB平板上劃線復(fù)蘇并重新進(jìn)行生化及血清學(xué)鑒定，以保證菌株的可靠性。 2.敏感野生株的篩選：采用Kirby-Bauer紙片法進(jìn)行菌株對(duì)四環(huán)素、氯霉素、氨芐青霉素、萘啶酸、氧氟沙星、諾氟沙星、環(huán)丙沙星的藥敏試驗(yàn)，以對(duì)以上抗菌藥物均敏感的菌株為敏感野生株(wild type，WT)，從中選擇一株作為實(shí)驗(yàn)誘導(dǎo)株。 3．誘導(dǎo)方法：諾氟沙星濃度從1/4×MIC<,0>(諾氟沙星對(duì)誘導(dǎo)株原代的最低抑

8、菌濃度)開始，以2倍遞增，每一濃度誘導(dǎo)兩代。當(dāng)諾氟沙星濃度達(dá)到1μg/ml后，濃度以1μg/ml遞增，直至誘導(dǎo)劑濃度大于或等于256×MIC<,0>。當(dāng)誘導(dǎo)劑的濃度達(dá)到4、8、16、32μg/ml時(shí)，菌株在該濃度中誘導(dǎo)培養(yǎng)兩天后，暫不繼續(xù)誘導(dǎo)傳代，先作4次無(wú)誘導(dǎo)劑傳代培養(yǎng)后，再接種于含相同濃度誘導(dǎo)劑的LB固體平皿過(guò)夜培養(yǎng)，挑選生長(zhǎng)良好的單菌落繼續(xù)誘導(dǎo)培養(yǎng)，以保證耐藥菌株為非適應(yīng)性耐藥。 4．抗菌藥物最低抑菌濃度(minimum

9、inhibition concentration，MIC)測(cè)定：用瓊脂稀釋法測(cè)定抗菌藥物諾氟沙星、四環(huán)素、氯霉素、氨芐青霉素對(duì)實(shí)驗(yàn)誘導(dǎo)株各代的最低抑菌濃度。 5．喹諾酮類作用的靶基因gyrA和parC的單鏈構(gòu)象多態(tài)性(PCR-SSCP)分析：PCR擴(kuò)增各代菌株的gyrA和parC基因，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)限制性內(nèi)切酶Hinf Ⅰ消化，變性后經(jīng)中性聚丙烯酰胺凝膠電泳，根據(jù)單鏈帶數(shù)目和位置判斷有無(wú)基因突變。 6．突變菌株P(guān)CR產(chǎn)物的D

10、NA測(cè)序。 7．能量抑制劑CCCP對(duì)實(shí)驗(yàn)誘導(dǎo)多重耐藥志賀菌主動(dòng)外排作用的抑制：用于瓊脂稀釋法藥敏試驗(yàn)的M-H培養(yǎng)基中加入能量抑制劑CCCP(10μg/ml)，測(cè)定諾氟沙星最低抑菌濃度MIC，觀察各代菌株加入抑制劑前后對(duì)抗菌藥物的MIC。 結(jié)果 1．菌株復(fù)蘇與鑒定：共復(fù)蘇菌株48株，其中江西銅鼓福氏志賀菌11株，鄭州福氏志賀菌13株，鄭州宋內(nèi)志賀菌8株，鄭州痢疾志賀菌3株，商丘睢縣福氏志賀菌12株，宋內(nèi)志賀菌1株。

11、 2．敏感野生株篩選：48株志賀菌中篩選出3株敏感野生株，N8、Z10、Z11，占菌株總數(shù)的6．25﹪。選擇N8作為實(shí)驗(yàn)誘導(dǎo)株。 3．誘導(dǎo)結(jié)果：共誘導(dǎo)傳代74代，諾氟沙星終濃度達(dá)32pg/ml，諾氟沙星對(duì)誘導(dǎo)株的最低抑菌濃度由_0．125μg/ml上升到128μg/ml，是原來(lái)的1024倍。同時(shí)其他三種結(jié)構(gòu)不同的抗生素TE、C、Am對(duì)其的最低抑菌濃度值也相應(yīng)上升為原來(lái)的128、64、32倍，誘導(dǎo)菌株由敏感野生株逐步轉(zhuǎn)變?yōu)?/p>

12、多重耐藥株。 4．gyrA基因、parC基因PCR擴(kuò)增：N8經(jīng)諾氟沙星誘導(dǎo)得到的各代菌株全部分別擴(kuò)增出648bp和469bp長(zhǎng)度的片段，分別是gyrA和parC基因的擴(kuò)增產(chǎn)物。 5．gyrA基因、parC基因的單鏈構(gòu)象多態(tài)性(PCR-SSCP)分析：對(duì)各代菌株研究，發(fā)現(xiàn)gyrA基因和parC基因分別呈現(xiàn)三種單鏈構(gòu)象圖譜，gyrA基因的突變可能發(fā)生在第12代和第55代，parC基因的突變可能發(fā)生在第21代和52代。

13、 6．突變菌株P(guān)CR產(chǎn)物的核酸序列分析：與N8原代的序列比較，gyrA基因在第12代即發(fā)生編碼第87位氨基酸的單個(gè)堿基突變(GAC→FAC)，在第55代發(fā)生了編碼第221位氨基酸的堿基突變(GGA→GCA)；parC基因在第21代發(fā)生編碼第80位氨基酸的堿基改變(AGC→AGA)，在第52代又有編碼第84位氨基酸的堿基改變(GAA→GCA)。 7．CCCP對(duì)受試菌MIC的影響：加入能量抑制劑CCCP后，敏感菌與耐藥菌的MIC均有

14、不同程度的降低。 結(jié)論 1．本研究從基因突變時(shí)序和耐藥程度的變化直接證實(shí)壓力環(huán)境與細(xì)菌形成耐藥的關(guān)系，為藥物選擇性——基因突變——耐藥形成理論提供直接的科學(xué)依據(jù)。 2．GyrA可能是喹諾酮類藥物作用的第一靶位，ParC可能是第二靶位。耐喹諾酮類藥物程度不同的菌株，其靶基因突變數(shù)量、涉及靶酶范圍不同。耐藥株靶基因突變存在多態(tài)性。 3．誘導(dǎo)株多重耐藥性的產(chǎn)生可能是由于激活了它的包括AcrAB在內(nèi)的主動(dòng)外排系統(tǒng)