辛伐他汀調(diào)控CTGF誘導(dǎo)心肌細(xì)胞肥大的作用及其與ERK1-2關(guān)系的研究.pdf

1、研究背景：心肌細(xì)胞肥大是高血壓左室肥厚（LVH）重要的細(xì)胞病理學(xué)基礎(chǔ)，闡明其發(fā)生及調(diào)控機(jī)制對心血管疾病的防治具有重要意義。左室肥厚是高血壓病一個重要的并發(fā)癥和引起病人死亡及相關(guān)疾病發(fā)生的獨(dú)立危險因素,主要包括兩方面的改變：一是心肌細(xì)胞的肥大；二是非心肌細(xì)胞的增殖和增生導(dǎo)致心肌膠原網(wǎng)絡(luò)改建，二者共同構(gòu)成了心臟重構(gòu)的病理基礎(chǔ)。許多資料表明，結(jié)締組織生長因子（CTGF）是可刺激心臟成纖維細(xì)胞增殖，膠原合成增多的生長因子，但它能否誘導(dǎo)心肌細(xì)胞肥

2、大及其作用的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制，目前還不十分清楚。高血壓治療的最終目標(biāo)是減少心血管事件發(fā)生和降低其致死率及致殘率，其中減輕或消退LVH、恢復(fù)心臟功能是治療的重要目標(biāo)。目前用于逆轉(zhuǎn)LVH作用的藥物主要有血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制劑、鈣離子拮抗劑、血管緊張素II受體拮抗劑和β受體阻滯劑等。但由于它們生物學(xué)效應(yīng)的局限，在臨床應(yīng)用上受到了一定的限制性。他汀類藥物為3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A（HMG-CoA）還原酶抑制劑，是膽固醇合成抑制劑，具有獨(dú)立于調(diào)

3、脂之外的心血管保護(hù)作用，能夠抑制血管平滑肌細(xì)胞增殖，逆轉(zhuǎn)左室肥厚。近年來，他汀類藥物抑制心肌細(xì)胞肥大，從而改善心臟重構(gòu)已成為一個學(xué)術(shù)界探討課題，但其具體的分子機(jī)制尚不十分清楚。細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶（ERK）是多種促生長信號傳導(dǎo)途徑的核心成分。ERK 1/2是ERK1和ERK2的統(tǒng)稱，是將信號從表面受體傳導(dǎo)至細(xì)胞核的關(guān)鍵。近年來的許多實(shí)驗(yàn)研究證明，ERK1/2的活化是促成心肌肥厚的重要因素，但其在CTGF誘導(dǎo)下心肌細(xì)胞肥大中有何作用，目前尚

4、不十分清楚。 研究目的 本研究在細(xì)胞和分子水平上觀察CTGF 對培養(yǎng)Sprague-Dawley（SD）大鼠心肌細(xì)胞肥大的作用與ERK1/2 的關(guān)系及辛伐他汀的干預(yù)效應(yīng)；探討CTGF 誘導(dǎo)心肌細(xì)胞肥大的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制。研究辛伐他汀抑制心肌細(xì)胞肥大的作用和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制，為辛伐他汀逆轉(zhuǎn)心肌肥厚提供理論依據(jù)和新的治療思路。 研究方法及內(nèi)容 本研究以乳鼠心肌細(xì)胞為研究對象，以培養(yǎng)的新生SD大鼠心肌細(xì)胞為實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?，?/p>

5、圖象分析法測定心肌細(xì)胞表面積，用[3H]一亮氨酸摻入法測定心肌細(xì)胞蛋白合成速率，用考馬斯亮蘭法測定心肌細(xì)胞蛋白含量，用蛋白免疫印跡法（western blot）測定心肌細(xì)胞總ERK1/2（t-ERK1/2）和磷酸化ERK1/2(p-ERK1/2)的蛋白表達(dá)水平。動態(tài)觀察：(1)CTGF對心肌細(xì)胞表面積、蛋白合成速率及蛋白含量的影響；(2)CTGF對心肌細(xì)胞總ERK1/2 和磷酸化ERK1/2 表達(dá)的影響； (3)辛伐他汀對CTGF誘導(dǎo)下

6、心肌細(xì)胞表面積、蛋白合成速率及蛋白含量的影響；(4) 辛伐他汀對CTGF誘導(dǎo)下心肌細(xì)胞總ERK1/2 和磷酸化ERK1/2 表達(dá)的影響。 研究結(jié)果 (1)隨著CTGF濃度的增加，心肌細(xì)胞表面積呈劑量依賴性增加，其中10μg/L、25μg/L、50μg/L、100 μg/L的CTGF組心肌細(xì)胞的表面積分別為929.88±132.21μm2、1411.31±129.16μm2、1731.99±152.96μm2、2040.6

7、2±205.37μm2,均明顯高于對照組心肌細(xì)胞表面積（606.34±72.70μm2）,差異非常顯著（p＜0.01）；100μmol/L的PD98059和100 μg/L的CTGF共同干預(yù)組心肌細(xì)胞表面積為1099.32±156.58μm2，明顯低于100 μg/L的CTGF組，并有統(tǒng)計學(xué)意義（p＜0.01）； (2)隨著CTGF濃度的增加，心肌細(xì)胞蛋白合成速率呈劑量依賴性增加，其中10μg/L、25μg/L、50μg/L、1

8、00μg/L的CTGF組心肌細(xì)胞[3H]-亮氨酸摻入率分別為1340.99±114.55 cpm/well、1598.81±154.62 cpm/well、2005.65±131.16 cpm/well、2277.28±176.96cpm/well, 均明顯高于對照組心肌細(xì)胞[3H]-亮氨酸摻入率(1141.27±134.95cpm/well ), 差異非常顯著（p＜0.01); 100μmol/L的PD98059和100 μg/L的C

9、TGF共同干預(yù)組心肌細(xì)胞[3H]-亮氨酸摻入率為1391.34±96.23cpm/well，明顯低于100 μg/L的CTGF組（p＜0.01)； (3)隨著CTGF濃度的增加，心肌細(xì)胞蛋白含量呈劑量依賴性增加，其中10μg/L、25μg/L、50μg/L、100μg/L的CTGF組心肌細(xì)胞蛋白含量分別為0.790±0.075 ng/cell、1.054±0.094 ng/cell、1.282±0.105 ng/cell、1.5

10、33±0.102ng/cell,均明顯高于對照組心肌細(xì)胞蛋白含量（0.673±0.080ng/cell）,差異分別為顯著和非常顯著（p＜0.05～0.01 ); 100μmol/L的PD98059和100 μg/L的CTGF共同干預(yù)組心肌細(xì)胞蛋白含量為1.069±0.079ng/cell，明顯低于100 μg/L的CTGF組（p＜0.01）； (4)隨著CTGF濃度的增加，心肌細(xì)胞P-ERK1/2表達(dá)呈劑量依賴性增高，10μg/

11、L、25μg/L、50μg/L、100μg/L的CTGF組的心肌細(xì)胞P-ERK1/2表達(dá)明顯高于對照組（p＜0.01），而t-ERK1/2在各組表達(dá)差異不明顯（p＞0.05）；CTGF作用后,在0min、5min、10min、15min、30min、60min、120min時間點(diǎn)，P-ERK1/2表達(dá)呈時間依賴性變化，其中0～15min時P-ERK1/2表達(dá)呈逐漸升高的趨勢，在15min時表達(dá)最高，以后則呈逐漸下降趨勢，而t-ERK1/

12、2在各時間點(diǎn)表達(dá)差異不明顯（p＞0.05）； (5)50μg/L CTGF組的心肌細(xì)胞表面積為1825.36±173.55μm2，與對照組（676.38±90.25μm2）比較顯著增加（P<0.01）; 10-7mol/L、10-6mol/L、10-5mol/L、10-4mol/L辛伐他汀干預(yù)組的心肌細(xì)胞表面積分別為1530.58±151.58μm2、1111.46±135.63μm2、901.18±110.47μm2、725.

13、24±92.35μm2，與CTGF組比較呈濃度依賴性降低（P<0.01）； (6)CTGF組的心肌細(xì)胞[3H]-亮氨酸摻入率為2300.55±115.47 cpm/well，與對照組（926.32±83.56 cpm/well）比較顯著增加（P<0.01）; 10-7mol/L、10-6mol/L、10-5mol/L、10-4mol/L辛伐他汀干預(yù)組的心肌細(xì)胞[3H]-亮氨酸摻入率分別為1989.36±101.22 cpm/we

14、ll、1551.14±102.55 cpm/well、1232.10±93.58cpm/well、1033.46±90.29cpm/well、與CTGF組比較呈濃度依賴性降低（P<0.01）； (7)CTGF組的心肌細(xì)胞蛋白含量為1.656±0.216 ng/cell，與對照組（0.635±0.072 ng/cell）比較顯著增加（P<0.01）; 10-7mol/L、10-6mol/L、10-5mol/L、10-4mol/Ls

15、im干預(yù)組的心肌細(xì)胞蛋白含量分別為1.206±0.152ng/cell、0.895±0.123 ng/cell、0.722±0.082 ng/cell、0.685±0.065ng/cell，與CTGF組比較呈濃度依賴性降低（P<0.01）； (8)CTGF組心肌細(xì)胞P-ERK1/2表達(dá)明顯高于對照組，10-7mol/L、10-6mol/L、10-5mol/L、10-4mol/L辛伐他汀干預(yù)組心肌細(xì)胞P-ERK1/2表達(dá)與CTGF

16、組比較呈濃度依賴性降低（P<0.01）；心肌細(xì)胞t-ERK1/2的表達(dá)在各組沒有明顯的差異（p＞0.05）。 研究結(jié)論 (1)CTGF可劑量依賴地誘導(dǎo)心肌細(xì)胞表面積增大、心肌細(xì)胞蛋白合成速率增高、心肌細(xì)胞蛋白含量增加，提示CTGF具有誘導(dǎo)心肌細(xì)胞肥大的作用； (2) CTGF可劑量依賴性和時間依賴性地誘導(dǎo)心肌細(xì)胞ERK1/2的磷酸化，ERK1/2的抑制劑PD98059可抑制和減輕心肌細(xì)胞表面積增大、蛋白合成速率增

17、高、蛋白含量增加的程度，表明CTGF誘導(dǎo)心肌細(xì)胞肥大的機(jī)制可能是通過ERK1/2的磷酸化來實(shí)現(xiàn)的； (3)辛伐他汀可劑量依賴性地抑制CTGF誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞表面積增大、心肌細(xì)胞蛋白合成速率增高、心肌細(xì)胞蛋白含量增加，提示辛伐他汀具有抑制CTGF誘導(dǎo)心肌細(xì)胞肥大的作用； (4)辛伐他汀可劑量依賴性地抑制CTGF誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞ERK1/2的磷酸化，表明辛伐他汀抑制CTGF誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞肥大可能是通過抑制ERK1/2的磷酸化來實(shí)