小鼠胰島分離純化和不同部位移植的研究.pdf

1、目的：
　　 通過(guò)改良胰島分離的灌注、消化、梯度離心等關(guān)鍵步驟，建立穩(wěn)定的胰島分離純化方案，同時(shí)探討適合胰島種植的部位，建立穩(wěn)定的胰島移植模型，為胰島移植相關(guān)研究奠定基礎(chǔ)。
　　 實(shí)驗(yàn)方法：
　　 采用雄性Balb/c、C57BL/6小鼠作為供體分離胰島，比較順行灌注和逆行灌注的效果差異，再以0.5mg/ml、1.0mg/ml、1.5mg/ml、2.0mg/ml四種濃度膠原酶Ⅺ消化胰腺，通過(guò)不同的梯度離心策略分離

2、純化胰島，進(jìn)行雙硫腙特異染色法（DTZ）染色，顯微鏡下觀察胰島的純度和得率，并通過(guò)吖啶橙（AO）/碘化丙啶（PI）染色檢查分離獲得的胰島活性，最終確定最佳的胰島分離純化方案。采用不同品系雄性小鼠（Balb/c、C57BL/6、C3H）誘導(dǎo)糖尿病模型，確定最佳的鏈脲酶素（streptozotocin，STZ）劑量，術(shù)后連續(xù)兩次血糖>18mmol/L為誘導(dǎo)糖尿病成功，術(shù)前血糖介于18-30mmol/L作為胰島移植受體。將上述分離純化的胰島種

3、植于糖尿病鼠腎包膜下、肝內(nèi)、腸系膜袢，通過(guò)監(jiān)測(cè)術(shù)后血糖波動(dòng)、術(shù)后糖耐量試驗(yàn)（IPGTT）、移植物病理學(xué)檢查等方式觀察胰島移植物功能情況。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用SPSS統(tǒng)計(jì)軟件，采用單因素方差分析比較不同實(shí)驗(yàn)組之間有無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，以P<0.05為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 結(jié)果：
　　 順行灌注法胰腺膨脹比例為：76.4±19.5％明顯優(yōu)于逆行灌注法（51.1±17.7％，P<0.05），0.5mg/ml膠原酶Ⅺ2ml/mouse灌注

4、，置于6ml0.5mg/ml膠原酶Ⅺ中，37℃水浴靜置消化15min，為最佳消化條件。Balb/c在Ficoll-1.108（4ml）、1.096（2ml）、1.069（2ml）、HBSS（2ml），加速度1減速度1400rpm4min中轉(zhuǎn)1800rpm8min離心后胰島得率為125±39IEQ，純度79.6±10.5％，經(jīng)相同條件二次梯度后得率無(wú)明顯變化但純度明顯提高96.2±1.4％.而C578L/6小鼠則適應(yīng)于加速度1減速度118

5、00rpm15min方案。經(jīng)AO/PI染色鑒定分離胰島活性良好。Balb/c、C57BL/6、C3H小鼠誘導(dǎo)糖尿病的最佳STZ劑量分別為:165mg/Kg，170mg/Kg和200mg/Kg，Balb/c的糖尿病誘導(dǎo)成功率明顯高于C57BL/6和C3H，誘導(dǎo)7天后達(dá)到糖尿病穩(wěn)態(tài)。腎包膜下胰島移植300-450IEQ足以糾正糖尿病，術(shù)后血糖恢復(fù)正常，術(shù)后30天獲取移植側(cè)腎臟行HE染色和胰島素免疫組化染色檢查，發(fā)現(xiàn)胰島存活良好，移植側(cè)腎切后

6、小鼠短期內(nèi)血糖重新達(dá)到種植前糖尿病狀態(tài)。相比之下肝內(nèi)移植效果較差，500IEQ不足降低小鼠血糖，且易產(chǎn)生肝臟栓塞導(dǎo)致受體死亡；而腸系膜袢內(nèi)胰島種植后血糖恢復(fù)正常需要相對(duì)較大的胰島移植量，約800IEQ。
　　 結(jié)論：
　　 我們改進(jìn)的小鼠胰島分離純化方法效果更佳，糖尿病模型穩(wěn)定、誘導(dǎo)成功率高，探針引導(dǎo)下經(jīng)PE管腎包膜下胰島種植建立的胰島移植模型，具有操作安全、簡(jiǎn)便，成功率高，模型穩(wěn)定的特點(diǎn)，該模型對(duì)進(jìn)行各種胰島移植相關(guān)研