褪黑素對視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤HXO-RB-,44-細(xì)胞成瘤性的影響.pdf

1、目的: (1)探討褪黑素對視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤HXO-RB44細(xì)胞增殖活性的影響及相關(guān)機制。 (2)探討褪黑素對HXO-RB44細(xì)胞上清液誘導(dǎo)的ARPE-19細(xì)胞內(nèi)VEGF表達(dá)的影響及相關(guān)機制。 (3)探討褪黑素對視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤HXO-RB44細(xì)胞周期異常及細(xì)胞凋亡的影響及相關(guān)機制。 (4)探討褪黑素對HXO-RB44細(xì)胞皮下移植瘤的生長抑制作用及其相關(guān)機制。 方法: (1)利用細(xì)胞計數(shù)、MTT

2、比色法，觀察體外培養(yǎng)條件下，不同濃度的MLT對視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤增殖活性的影響；利用流式細(xì)胞儀測定濃度為10-5M的MLT干預(yù)不同時間(12h、24h、36h、48h)，以及不同濃度的MLT(10-6、10-5、10-4、10-3M)干預(yù)24h，HXO-RB44細(xì)胞內(nèi)活性氧的表達(dá)情況。 (2)選取HXO-RB44細(xì)胞上清液，對體外培養(yǎng)的ARPE-19細(xì)胞進(jìn)行干預(yù)，在HXO-RB44細(xì)胞上清液干預(yù)的ARPE-19細(xì)胞內(nèi)分別加入10-9

3、、10-7、10-5M的MLT，利用RT-PCR、免疫熒光細(xì)胞化學(xué)、Western-blot等方法，分別觀察單獨用上清液以及上清液+不同濃度的MLT干預(yù)后24h ARPE-19細(xì)胞內(nèi)VEGF mRNA及蛋白質(zhì)的表達(dá)情況。 (3)將體外培養(yǎng)的HXO-RB44細(xì)胞，分別利用不同濃度的MLT(10-10、10-9、10-8、10-7M)進(jìn)行干預(yù)24h，或利用10-7M的MLT進(jìn)行干預(yù)4h、8h、12h、24h。采用Hoechst熒光染

4、色觀察細(xì)胞核凋亡的形態(tài)學(xué)改變；流式細(xì)胞儀監(jiān)測分析細(xì)胞周期與凋亡；RT-PCR、免疫細(xì)胞化學(xué)及Western-blot從mRNA及蛋白水平檢測P21、P27基因的變化。 (4)建立50只RB裸鼠皮下移植瘤模型，隨機分成5組：低、中、高濃度組分別按每只每次腹腔注射MLT 20mg/kg、40mg/kg、60mg/kg各2mL進(jìn)行給藥，陰性對照組注射等量生理鹽水，陽性對照組每只每次腹腔注射等量VP-16(4mg/kg)，每天給藥一次，

5、共7次。觀察各組裸鼠皮下移植瘤生長情況、裸鼠體重的變化。采用組織病理學(xué)檢查，觀察裸鼠移植瘤的形態(tài)學(xué)特征；采用免疫組化、Western-blot檢測腫瘤細(xì)胞VEGF、ICAM-1的表達(dá)情況。 結(jié)果: (1)濃度為10-7M以下的MLT不能抑制HXO-RB44細(xì)胞增殖，濃度為10-6以上的MLT能夠顯著抑制HXO-RB44細(xì)胞增殖，隨著作用時間的延長，其抑制效率增強。10-5M的MLT干預(yù)后不同時間點，隨著干預(yù)時間的延長，H

6、XO-RB44細(xì)胞內(nèi)ROS濃度逐漸升高；藥物濃度介于10-6M與10-4M之間的MLT，隨藥物濃度的升高，HXO-RB44細(xì)胞內(nèi)ROS的表達(dá)逐漸升高。 (2)HXO-RB44細(xì)胞上清液作用后4h、8h、12h、24h，ARPE-19細(xì)胞內(nèi)VEGF mRNA及蛋白質(zhì)呈高表達(dá)。不同濃度的MLT干預(yù)24小時，隨MLT濃度的增大，各組ARPE-19細(xì)胞內(nèi)VEGFmRNA及蛋白質(zhì)的表達(dá)逐漸降低。 (3)不同濃度的褪黑素分別作用于培

7、養(yǎng)的HXO-RB44細(xì)胞4h、8h、12h、24h后，細(xì)胞核固縮、核碎裂增多；藥物干預(yù)后，G0/G1期細(xì)胞明顯增多，S期細(xì)胞減少，G2/M期細(xì)胞相對增多；各組細(xì)胞核內(nèi)均有P21、P27的表達(dá)。與陰性對照組相比，MLT干預(yù)組細(xì)胞內(nèi)P21、P27mRNA及蛋白質(zhì)的表達(dá)增強，并具有濃度及時間依賴性。 (4)40mg/kg、60mg/kg的MLT能明顯抑制裸鼠移植瘤的生長。低、中、高劑量的MLT治療組以及陽性對照組，裸鼠移植瘤抑瘤率分別

8、為12.5％、27.89％、40.72％、44.52％。組織病理學(xué)檢查發(fā)現(xiàn)治療組及陽性對照組移植瘤內(nèi)出血、壞死的程度明顯高于陰性對照組；免疫組化、Western-blot結(jié)果顯示治療組VEGF、ICAM-1的表達(dá)明顯低于對照組。 結(jié)論: (1)10-6M以上濃度的MLT能夠有效地抑制HXO-RB44細(xì)胞增殖，其抑制效率隨藥物濃度的升高和作用時間的延長而增強；MLT的抗細(xì)胞增殖作用可能與其誘導(dǎo)HXO-RB44細(xì)胞內(nèi)的活性氧

9、產(chǎn)生有關(guān)。 (2)HXO-RB44細(xì)胞上清液能促進(jìn)ARPE-19細(xì)胞內(nèi)VEGF的表達(dá)，隨干預(yù)時間的延長，ARPE-19細(xì)胞內(nèi)VEGF的表達(dá)增強。MLT能抑制HXO-RB44細(xì)胞上清液誘導(dǎo)的ARPE-19細(xì)胞內(nèi)VEGF的高表達(dá)，隨著藥物濃度的增大，ARPE-19細(xì)胞內(nèi)VEGF表達(dá)降低。 (3)褪黑素能夠阻滯HXO-RB44細(xì)胞周期于G0/G1期，促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)P21、P27mRNA及蛋白質(zhì)的高表達(dá)并誘導(dǎo)HXO-RB44細(xì)胞凋亡