內(nèi)臟神經(jīng)-體神經(jīng)端側(cè)吻合修復(fù)直腸功能可行性研究.pdf

1、本文主要從以下幾個(gè)部分展開論述：
　　第一部分 內(nèi)臟神經(jīng)-體神經(jīng)端側(cè)吻合重建大鼠直腸及肛門外括約肌神經(jīng)支配的神經(jīng)追蹤研究
　　目的:應(yīng)用神經(jīng)追蹤技術(shù)研究?jī)?nèi)臟神經(jīng)與體神經(jīng)端側(cè)吻合后神經(jīng)再生方式及大鼠直腸及肛門外括約肌傳出神經(jīng)通路。
　　方法:成年 SPF級(jí)雄性 SD大鼠36只(240～300g)隨機(jī)分為四組:端側(cè)吻合組(n=15),背部正中切口行 L3～S1椎板切除術(shù),于左側(cè) L4VR側(cè)面神經(jīng)外膜開窗,在 L3水平將左側(cè)

2、 L6和S1脊神經(jīng)切斷,將 L6VR尾端螺旋狀纏繞于 L4VR上,并將 L6VR尾端端側(cè)吻合于 L4VR的側(cè)面。損傷組(n=6),左側(cè) L6和S1脊神經(jīng)切斷,不進(jìn)行吻合。對(duì)照組(n=6),除 L6脊神經(jīng)前根外的左側(cè) L6和S1脊神經(jīng)全部切斷。正常大鼠組(n=9),不做任何處理。在16周時(shí),端側(cè)吻合組、損傷組及對(duì)照組各6只,將熒光金(Fluorogold,FG)注射至左側(cè)盆神經(jīng)節(jié),3天后將快藍(lán)(Fast Blue,FB)注射至左側(cè)坐骨神經(jīng)

3、,大鼠再存活7天后取脊髓行冰凍切片熒光顯微鏡下觀察。端側(cè)吻合組及正常大鼠組各9只平均分三組,第一組 L4脊髓前角注射 HRP,第二組 MPG內(nèi)注射3％快藍(lán),第三組直腸壁注射4％熒光金。EAS10um橫向切片,EAS HRP-TMB顯色后光學(xué)顯微鏡下觀察。脊髓行冰凍切片熒光顯微鏡下觀察被熒光標(biāo)記的神經(jīng)元。
　　結(jié)果:逆行追蹤結(jié)果顯示在端側(cè)吻合組 FG-FB雙標(biāo)神經(jīng)元、FG單標(biāo)神經(jīng)元主要分布在左側(cè) L4脊髓前角,左側(cè) L3至 L5脊髓

4、前角可見 FB單標(biāo)神經(jīng)元,L6脊髓未見標(biāo)記的神經(jīng)元。在損傷組,L3到 L5脊髓段只有 FB單標(biāo)神經(jīng)元,無 FG單標(biāo)或 FG- FB雙標(biāo)神經(jīng)元,L6脊髓段未見被標(biāo)記的神經(jīng)元。在對(duì)照組中,FG單標(biāo)記和FB單標(biāo)神經(jīng)元分別出現(xiàn)在 L6和L3～L5脊髓段,無雙標(biāo)神經(jīng)元。在左側(cè) L4脊髓前角注射 HRP后,端側(cè)吻合組肛門外括約肌中可觀察到 HRP陽性標(biāo)記的神經(jīng)末梢,在正常大鼠組無 HRP陽性標(biāo)記的神經(jīng)末梢。端側(cè)吻合組與正常大鼠組,直腸壁注射 FG后

5、可在 MPG觀察到 FG標(biāo)記神經(jīng)元,MPG注射 FB后可分別在脊髓 L4和L6～S1節(jié)段觀察到 FB標(biāo)記神經(jīng)元。
　　結(jié)論:在端側(cè)吻合組脊髓 L4節(jié)段 FG-FB雙標(biāo)神經(jīng)元較多,證明內(nèi)臟神經(jīng)-端側(cè)吻合后,再生神經(jīng)主要再生方式是體神經(jīng)側(cè)枝發(fā)芽。少量 FG單標(biāo)由縫合過程中供體神經(jīng)損傷引起的軸突的再生。端側(cè)吻合后支配直腸及肛門外括約肌的脊髓中樞發(fā)生了改變,由 L6、S1脊髓節(jié)段轉(zhuǎn)移到了L4脊髓節(jié)段。
　　第二部分 內(nèi)臟神經(jīng)-體神經(jīng)

6、端側(cè)吻合后再生神經(jīng)形態(tài)學(xué)研究
　　目的:觀察內(nèi)臟神經(jīng)-體神經(jīng)端側(cè)吻合后再生神經(jīng)纖維的形態(tài)學(xué)特點(diǎn)。
　　方法:成年 SPF級(jí)雄性 SD大鼠24只(240～300g)隨機(jī)分為三組:端側(cè)吻合組(n=8),左側(cè) L6和S1脊神經(jīng)切斷,將 L6VR尾端端側(cè)吻合于 L4VR的側(cè)面。損傷組(n=8),左側(cè) L6和S1脊神經(jīng)切斷,不進(jìn)行吻合。對(duì)照組(n=8),除 L6脊神經(jīng)前根外的左側(cè) L6和S1脊神經(jīng)全部切斷。術(shù)后16周,沿 MPG找到左

7、側(cè)盆副交感神經(jīng)(left pelvic parasympathetic nerves, PPN),在手術(shù)顯微鏡下取下5 mm PPN神經(jīng)段及吻合口近端5 mm L6神經(jīng)段。PPN及L6神經(jīng)段用于電鏡觀察超微結(jié)構(gòu)特點(diǎn)。PPN1um半薄切片甲苯胺藍(lán)染色后統(tǒng)計(jì)再生神經(jīng)纖維數(shù)量。
　　結(jié)果:神經(jīng)超微結(jié)構(gòu)顯示:在端側(cè)吻合組再生神經(jīng) L6VR可見大量的有髓神經(jīng)纖維、無髓神經(jīng)纖維。再生神經(jīng) PPN可見大量的有髓神經(jīng)纖維、無髓神經(jīng)纖維。損傷組 P

8、PN切片中幾乎見不到有髓神經(jīng)纖維軸突。端側(cè)吻合組與對(duì)照組盆副交感神經(jīng)的有髓神經(jīng)纖維平均數(shù)量分別為263±66和579±84。
　　結(jié)論:L6VR和L4VR進(jìn)行端側(cè)吻合后 L4VR運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元軸突可以長(zhǎng)入 L6VR,可見大量的再生有髓神經(jīng)纖維、無髓神經(jīng)纖維。我們的組織形態(tài)學(xué)實(shí)驗(yàn)證實(shí)再生神經(jīng) PPN平均有髓軸突數(shù)量可達(dá)到對(duì)照組 PPN的45.4％。
　　第三部分 內(nèi)臟神經(jīng)-體神經(jīng)端側(cè)吻合后肛腸功能及端側(cè)吻合對(duì)供體神經(jīng)影響的研究

9、r>　　目的:本實(shí)驗(yàn)利用肛腸動(dòng)力學(xué)技術(shù)研究?jī)?nèi)臟神經(jīng)-體神經(jīng)端側(cè)吻合后直腸平滑肌和肛門外括約肌(external anal sphincter, EAS)協(xié)同情況及其可能機(jī)制,應(yīng)用肌電圖和形態(tài)學(xué)技術(shù)研究?jī)?nèi)臟神經(jīng)-體神經(jīng)端側(cè)吻合術(shù)對(duì)供體神經(jīng)的影響。
　　方法:成年雄性 SPF級(jí) SD大鼠24只(240-300g)隨機(jī)分為三組:端側(cè)吻合組(n=8),左側(cè) L6和S1脊神經(jīng)切斷,并將 L6VR尾端與 L4VR行端側(cè)吻合。損傷組(n=8),

10、左側(cè) L6和S1脊神經(jīng)切斷,不進(jìn)行吻合。對(duì)照組(n=8),除 L6脊神經(jīng)前根外的左側(cè) L6和S1脊神經(jīng)全部切斷。術(shù)后16周,端側(cè)吻合組刺激 L4VR同時(shí)記錄直腸壓力及肛門外括約肌肌電圖。在損傷組刺激 L4VR,對(duì)照組分別刺激L4VR及L6VR同時(shí)記錄直腸壓力及肛門外括約肌肌電圖。術(shù)后16周用BL-410生物實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)檢測(cè)脛骨前肌及腓腸肌肌電圖。沿肌腱起始處仔細(xì)分離完整取左右兩側(cè)脛骨前肌測(cè)量肌肉濕重,并進(jìn)行 HE染色觀察肌肉形態(tài)。端側(cè)吻合組

11、在L4供體神經(jīng)吻合口遠(yuǎn)端和吻合口近端分別取5mm神經(jīng)片段,對(duì)照組取相應(yīng)位置 L4神經(jīng)片段,石蠟切片甲苯胺藍(lán)染色(Toluidine blue,TB)統(tǒng)計(jì)有髓神經(jīng)纖維數(shù)量。
　　結(jié)果:端側(cè)吻合組刺激 L4VR吻合口近端時(shí)肛門直腸測(cè)壓顯示肛門直腸壓力在逐步上升,同時(shí)誘發(fā)EAS的電活動(dòng)減弱或消失,最大的肛門直腸壓力達(dá)到27.9±4.5 cm H2O。在損傷組刺激左側(cè) L4VR時(shí)肛門直腸壓力沒有上升。在對(duì)照組中,刺激L6VR時(shí)最大的肛門直

12、腸壓力達(dá)到68.4±6.6 cm H2O,用同樣的參數(shù)刺激左側(cè)L4VR肛門直腸壓力無明顯升高。左右兩側(cè)脛骨前肌的重量分別為0.688±0.061g和0.694±0.059g,兩者差別無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p>0.1)。左右兩側(cè)脛骨前肌及腓腸肌肌電圖都未見失神經(jīng)電位,未見明顯肌肉纖維萎縮及變性。L4供體神經(jīng)吻合口前后神經(jīng)段及對(duì)照組 L4神經(jīng)纖維數(shù)量分別為875±83、869±64和882±75,三組神經(jīng)纖維數(shù)量無顯著性差異。
　　結(jié)論:在端