黃河鯉卵巢發(fā)育早期相關(guān)基因與信號(hào)通路的鑒定和作用研究.pdf

1、生殖是生命有機(jī)體非常重要的生物特征，而卵巢的發(fā)育分化是有性生殖的基本前提。魚(yú)類是脊椎動(dòng)物中種類最多的類群，具有重要的經(jīng)濟(jì)價(jià)值。魚(yú)類卵巢分化發(fā)育的類型眾多，影響其分化發(fā)育的遺傳因素和環(huán)境因素繁雜。研究魚(yú)類卵巢分化發(fā)育的分子機(jī)制不僅有利于漁業(yè)生產(chǎn)的發(fā)展，對(duì)于人們了解生物性別決定機(jī)制也具有重要意義。黃河鯉（Cyprinus carpio）是河南省乃至全國(guó)重要的淡水養(yǎng)殖魚(yú)類，其生長(zhǎng)具有明顯的性別二態(tài)性，雌性生長(zhǎng)較雄性快。目前鯉魚(yú)卵巢分化發(fā)育的機(jī)

2、制研究較少，影響其分化發(fā)育的遺傳因素和環(huán)境因素也不清楚。為了全面研究黃河鯉卵巢分化發(fā)育的調(diào)控機(jī)制，尋找調(diào)控卵巢分化發(fā)育的分子機(jī)制和關(guān)鍵基因，本研究首先從組織學(xué)水平上確定了黃河鯉原始性腺向卵巢分化的關(guān)鍵時(shí)間，通過(guò)分析卵巢不同發(fā)育階段的轉(zhuǎn)錄物組信息，找到了與卵巢分化發(fā)育過(guò)程密切相關(guān)的候選基因和信號(hào)通路，通過(guò)研究這些基因結(jié)構(gòu)與時(shí)空表達(dá)模式，確定了其在卵巢分化發(fā)育中的作用;同時(shí)研究了信號(hào)通路對(duì)卵巢分化的影響及其作用機(jī)制。本文還對(duì)環(huán)境內(nèi)分泌干擾物

3、TPT對(duì)黃河鯉性腺分化的影響進(jìn)行了分析，通過(guò)分析TPT處理后性腺的轉(zhuǎn)錄物組信息，發(fā)現(xiàn)了其影響卵巢分化的分子機(jī)制。獲得以下創(chuàng)新結(jié)果:
　　1.確定了黃河鯉性腺分化的關(guān)鍵時(shí)間。
　　通過(guò)組織學(xué)切片，原始性腺在幼魚(yú)40 dpf時(shí)可以從顯微鏡下分離，其在55 dpf之前保持未分化狀態(tài)，在70 dpf出現(xiàn)了卵巢的分化。我們對(duì)性腺發(fā)育相關(guān)基因的表達(dá)水平從原始性腺到幼稚卵巢期間進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)在多數(shù)基因在50 dpf發(fā)生顯著變化。根據(jù)原始性

4、腺分化為精卵巢的關(guān)鍵時(shí)間早于性腺發(fā)生的組織結(jié)構(gòu)變化，我們認(rèn)為黃河鯉性腺分化的關(guān)鍵時(shí)期在45-50 dpf。
　　2.分析比較了原始性腺、幼稚卵巢和成熟卵巢的轉(zhuǎn)錄物組，發(fā)現(xiàn)與卵巢分化高度相關(guān)的差異表達(dá)基因和信號(hào)通路。
　　將45 dpf原始性腺，80dpf幼稚卵巢和排卵前的成熟卵巢進(jìn)行轉(zhuǎn)錄物組測(cè)序。在原始性腺、幼稚卵巢和成熟卵巢中分別發(fā)現(xiàn)了1788，1681和1256個(gè)特異表達(dá)的基因。研究發(fā)現(xiàn)原始性腺和幼稚卵巢的差異基因有29

5、679個(gè)，原始性腺和成熟卵巢的基因間表達(dá)差異的基因有31150個(gè)，幼稚卵巢和成熟卵巢間有21201個(gè)差異基因。通過(guò)對(duì)差異表達(dá)基因(DEGs)進(jìn)行GO和KEGG分析，得到卵巢分化發(fā)育密切相關(guān)的基因，如foxl2、dax1、lhx8、dnmt1等基因。對(duì)4個(gè)與卵巢早期發(fā)育相關(guān)的候選基因foxl2、dax1、lhx8、dnmt1進(jìn)行了詳細(xì)的基因結(jié)構(gòu)和表達(dá)模式分析。4個(gè)基因均為首次在黃河鯉報(bào)道其結(jié)構(gòu)和表達(dá)模式。這些基因與卵巢分化有著密切的關(guān)系，

6、推測(cè)其可能參與黃河鯉性腺分化和精卵巢早期的分化調(diào)控。
　　通過(guò)DEGs的KEGG顯著富集分析，發(fā)現(xiàn)notch、NF-κB、范可尼貧血、類固醇生物合成，孕酮介導(dǎo)的卵母細(xì)胞成熟、PPAR等信號(hào)通路參與了卵巢的分化。
　　3.研究notch和NF-κB信號(hào)通路在黃河鯉卵巢發(fā)育中的作用，發(fā)現(xiàn)抑制notch信號(hào)可以促進(jìn)卵巢分化，抑制NF-κB信號(hào)則抑制卵巢分化。
　　利用notch信號(hào)通路抑制劑DAPT對(duì)原始性腺進(jìn)行短期體外處理

7、和對(duì)幼魚(yú)為期30天的水體暴露試驗(yàn)。短期處理結(jié)果顯示發(fā)現(xiàn)DAPT可以抑制原始性腺中的notch信號(hào)和amh，dmrt1，sox9a，sf1，dax1基因的表達(dá)，增強(qiáng)foxl2，gdf9，nobox基因表達(dá)。長(zhǎng)期暴露實(shí)驗(yàn)顯示，DAPT可以抑制notch信號(hào)，并促進(jìn)原始性腺向卵巢的分化，這也是首次證明該信號(hào)通路參與調(diào)控魚(yú)類的性腺分化，抑制該通路可以顯著促進(jìn)卵巢分化。
　　利用NF-κB信號(hào)通路激活劑DOC和抑制劑NAI，在黃河鯉卵巢分化

8、的關(guān)鍵時(shí)期，對(duì)原始性腺分別短期處理和長(zhǎng)期水體暴露試驗(yàn)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)激活NF-κB信號(hào)通路，誘導(dǎo)了il-8，tnf-α、抗凋亡基因xiap和雌性發(fā)育相關(guān)基因zp2，foxl2表達(dá)上調(diào)，凋亡相關(guān)基因casp3a，smac基因表達(dá)下調(diào)，雌性比例增加。抑制NF-κB信號(hào)通路，則NF-κB，tnf-α，il8，xiap基因表達(dá)下調(diào)，并提高了促進(jìn)了amh，sox9a，dax1基因，凋亡基因smac和casp3a的表達(dá)，降低了雌性的性別比例。說(shuō)明該通路參

9、與黃河鯉卵巢的早期分化發(fā)育。另外zp2，foxl2、amh，sox9a，sf1，dax1基因在處理后表達(dá)顯著變化，說(shuō)明這些基因受到NF-κB信號(hào)通路的調(diào)控，從而在性腺分化中發(fā)揮作用。這一結(jié)果不僅驗(yàn)證了黃河鯉性腺分化的關(guān)鍵時(shí)間，同時(shí)還發(fā)現(xiàn)了新的信號(hào)通路可能通過(guò)調(diào)控炎癥分子和細(xì)胞調(diào)亡參與黃河鯉卵巢分化。
　　4.分析了TPT對(duì)黃河鯉幼體的長(zhǎng)期體內(nèi)處理和不同時(shí)期性腺的短期體外處理結(jié)果，發(fā)現(xiàn)TPT可以顯著改變幼體性腺分化的比例，其可能的分

10、子機(jī)制是通過(guò)改變?cè)夹韵僦姓{(diào)控卵巢分化的關(guān)鍵基因和信號(hào)通路尤其是類固醇激素生物合成通路而實(shí)現(xiàn)的。
　　綜上所述，本研究確定了黃河鯉性腺發(fā)育的關(guān)鍵時(shí)間，發(fā)現(xiàn)了與卵巢分化早期的調(diào)控基因和信號(hào)通路，詳盡研究了這些基因和信號(hào)通路在卵巢發(fā)育過(guò)程中的作用;同時(shí)發(fā)現(xiàn)了與TPT影響黃河鯉性腺分化有關(guān)的基因和信號(hào)通路，揭示了TPT作為性激素類似物的分子機(jī)理。這些結(jié)果為揭示魚(yú)類的卵巢分化的分子機(jī)理奠定了堅(jiān)實(shí)基礎(chǔ)，對(duì)于水產(chǎn)養(yǎng)殖有著重要的理論意義和實(shí)踐意