DHHC蛋白家族成員(ZDHHC16、ZDHHC17)在神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育過程中作用及其機(jī)制的研究.pdf

1、本文主要從以下幾方面進(jìn)行了論述：
　　第一部分 ZDHHC16在神經(jīng)干細(xì)胞增殖中的作用及機(jī)制研究
　　首先，為了了解ZDHHC16在斑馬魚胚胎的時空表達(dá)模式，本研究設(shè)計合成了zdhhc16特異性引物和地高辛標(biāo)記的RNA探針，利用RT-PCR技術(shù)和WISH技術(shù)，檢測zdhhc16在斑馬魚胚胎發(fā)育各時期的表達(dá)以及分布情況。結(jié)果表明，zdhhc16為母源性表達(dá)，且在神經(jīng)板形成階段，表達(dá)水平顯著增高。同時，zdhhc16集中表達(dá)于斑

2、馬魚胚胎神經(jīng)板的最前端，這一結(jié)果暗示該基因可能參與調(diào)節(jié)神經(jīng)系統(tǒng)特別是前腦的發(fā)育過程。
　　為了研究ZDHHC16對斑馬魚神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育的影響，本研究利用反向遺傳學(xué)手段，設(shè)計合成針對zdhhc16的Morpholino(MO)，在斑馬魚胚胎發(fā)育至1-2細(xì)胞期時利用顯微注射技術(shù)注入胚胎，觀察表型。結(jié)果顯示，與對照組相比，抑制ZDHHC16表達(dá)后，在胚胎發(fā)育至10hpf(Hours post fertilization)時，神經(jīng)板前端表現(xiàn)

3、出缺陷，至24hpf時胚胎呈現(xiàn)出端腦體積縮小甚至缺失的表型。48hpf胚胎石蠟切片HE染色結(jié)果也證實了這一結(jié)果。為了進(jìn)一步揭示ZDHHC16對胚胎神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育，尤其是明確其在端腦發(fā)育中的作用，本研究利用原位雜交技術(shù)，檢測多個標(biāo)志基因的表達(dá)變化。結(jié)果顯示，抑制ZDHHC16表達(dá)后，24hpf胚胎中后腦的標(biāo)記基因otx2(Orthodenticlehomeobox2)，pax2a(Paired box2a)，krox20(Early gro

4、wth response2)表達(dá)均正常，而端腦標(biāo)記基因foxg1（Forkhead box G1），emx2(Empty spiracles homeobox2)，dlx2(Distal-less homeobox2)的表達(dá)均出現(xiàn)不同程度的減弱，免疫組化檢測神經(jīng)元標(biāo)記基因acetylatedα-tubulin的表達(dá)也進(jìn)一步證實了這一結(jié)果。上述結(jié)果暗示ZDHHC16在神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育過程中參與端腦發(fā)育的調(diào)控。由于抑制ZDHHC16后胚胎在神經(jīng)

5、發(fā)育早期出現(xiàn)缺陷，因此我們利用原位雜交技術(shù)，在神經(jīng)板形成階段（75％下包期）檢測神經(jīng)標(biāo)記基因sox3(Sex determining region Y-box3)和rx3(Retinalhomeobox gene3)的表達(dá)。結(jié)果顯示，與對照組相比，其在神經(jīng)板前端的表達(dá)減弱，提示ZDHHC16可能參與了胚胎端腦神經(jīng)干細(xì)胞生命活動的調(diào)控。
　　接下來，分別在體內(nèi)水平和體外水平，研究ZDHHC16對端腦神經(jīng)干細(xì)胞的作用。利用原位雜交和R

6、T-PCR技術(shù)檢測神經(jīng)干細(xì)胞標(biāo)記基因sox2的表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)抑制ZDHHC16后sox2（Sex determining region Y-box2）的表達(dá)減弱，mRNA水平降低，提示神經(jīng)干細(xì)胞的數(shù)量減少。接著，利用BrdU摻入實驗，RT-PCR和原位雜交檢測增殖相關(guān)基因-pcna(Proliferating cell nuclear antigen)和mcm5(Minichromosomemaintenance complex com

7、ponent5)，切片TUNEL染色技術(shù)，分別檢測端腦處神經(jīng)干細(xì)胞的增殖水平和凋亡情況。結(jié)果顯示，抑制ZDHHC16的表達(dá)后，凋亡的神經(jīng)干細(xì)胞數(shù)量沒有明顯的變化，而端腦處神經(jīng)干細(xì)胞的增殖水平減弱。同時，在體外培養(yǎng)的原代神經(jīng)干細(xì)胞中得到的實驗結(jié)果，與體內(nèi)的結(jié)果一致，也進(jìn)一步驗證了上述結(jié)論。
　　最后，為了探索ZDHHC16調(diào)控端腦神經(jīng)干細(xì)胞增殖的機(jī)制。本研究利用RT-PCR技術(shù)檢測參與神經(jīng)干細(xì)胞增殖的多條信號通路下游關(guān)鍵因子的表達(dá)水

8、平，結(jié)果顯示，抑制ZDHHC16的表達(dá)，F(xiàn)GF通路下游的轉(zhuǎn)錄因子pea（ets variant4），erm(etsvariant5)的mRNA表達(dá)水平顯著下降，接著，通過Western blot檢測FGF通路關(guān)鍵效應(yīng)蛋白ERK的磷酸化水平，結(jié)果也出現(xiàn)了顯著的下調(diào)。此外，利用Western blot技術(shù)檢測FGF通路中配體和受體蛋白的表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)抑制ZDHHC16并不會影響上述基因mRNA和蛋白的表達(dá)水平，暗示ZDHHC16通過影響ER

9、K上游激酶的活性發(fā)揮作用。同時，本研究通過體外合成ZDHHC16△DHHC表達(dá)載體，與zdhhc16 MO共同注射斑馬魚胚胎進(jìn)行挽救實驗，發(fā)現(xiàn)ZDHHC16△DHHC并不能像野生型ZDHHC16一樣挽救注射表型，上調(diào)ERK的磷酸化水平，因此我們推測ZDHHC16通過其棕櫚酰化修飾作用，影響ERK上游的MEK蛋白激酶的活性，調(diào)節(jié)ERK的磷酸化水平，進(jìn)而發(fā)揮調(diào)控端腦神經(jīng)干細(xì)胞增殖的功能。
　　第二部分 ZDHHC17在神經(jīng)元軸突生長過

10、程中的作用及機(jī)制研究
　　首先，為了研究ZDHHC17在斑馬魚胚胎神經(jīng)發(fā)育中的作用，本部分研究利用RT-PCR技術(shù)和WISH技術(shù)，檢測zdhhc17 mRNA在斑馬魚胚胎中的時空表達(dá)譜。結(jié)果顯示，zdhhc17集中表達(dá)于神經(jīng)系統(tǒng)，且從尾芽期開始，表達(dá)水平顯著增高。接著，我們選取1-2細(xì)胞期胚胎，顯微注射zdhhc17 MO抑制ZDHHC17蛋白的翻譯，構(gòu)建ZDHHC17-knockdown胚胎模型，同時注射小鼠zdhhc17 mR

11、NA構(gòu)建ZDHHC17-overexpression模型，并觀察表型。結(jié)果顯示，抑制ZDHHC17表達(dá)的胚胎外觀與注射Con MO的胚胎沒有差別。但是Touch-response test結(jié)果顯示，抑制ZDHHC17表達(dá)后，發(fā)育至3dpf(Days post fertilization)的胚胎，運(yùn)動能力明顯降低，表現(xiàn)為受刺激后游動速率減慢，游動距離縮短。利用免疫熒光染色技術(shù)檢測神經(jīng)元標(biāo)記基因Znp-1，結(jié)果顯示，胚胎發(fā)育至28hpf，抑

12、制組胚胎的運(yùn)動神經(jīng)元軸突的生長受限，而過表達(dá)組胚胎的運(yùn)動神經(jīng)元軸突則呈現(xiàn)生長過度的傾向。然而，對于22hpf胚胎的Islet1(ISLLIM homeobox1)的染色結(jié)果表明，各組間神經(jīng)元生成的數(shù)量并沒有明顯的差異，提示該蛋白的功能可能與神經(jīng)元軸突的生成密切相關(guān)，并不影響神經(jīng)干細(xì)胞向神經(jīng)元方向的分化過程。為了進(jìn)一步驗證在體內(nèi)模型中觀察到的結(jié)果，本研究又建立了原代培養(yǎng)神經(jīng)干細(xì)胞定向誘導(dǎo)為神經(jīng)元模型和NGF誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞定向分化的體外

13、模型，通過RNAi技術(shù)抑制ZDHHC17的表達(dá)，觀察神經(jīng)元分支生長情況和神經(jīng)元生成的數(shù)量，得到的結(jié)果均與體內(nèi)結(jié)果一致。
　　接下來，為了探索ZDHHC17調(diào)控神經(jīng)元軸突生長的作用機(jī)制，本研究以NGF誘導(dǎo)的定向分化為神經(jīng)元的PC12細(xì)胞為模型，利用Western blot技術(shù)檢測參與調(diào)控神經(jīng)元分化的重要信號通路-絲裂原活化蛋白激酶(Mitogen-activated protein kinase，MAPK)家族中的關(guān)鍵因子，包括p-

14、ERK(phosphorylated extracellular regulated MAPkinase，p-ERK)，p-JNK，p-p38，結(jié)果表明，在抑制ZDHHC17的表達(dá)后，ERK的磷酸化水平顯著下降，而p-JNK和p-p38的表達(dá)則無明顯變化。
　　因此，本研究繼續(xù)探索ZDHHC17促進(jìn)ERK磷酸化的機(jī)制。分析ZDHHC17的蛋白結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)其不含有激酶結(jié)構(gòu)域，因此我們推測ZDHHC17通過影響ERK上游其他激酶的活性調(diào)

15、控ERK磷酸化。我們構(gòu)建帶有GFP標(biāo)簽的ZDHHC17表達(dá)載體，利用免疫共沉淀技術(shù)，檢測ZDHHC17與ERK上游的激酶TrkA(Tyrosine kinase A，TrkA)和cAMP依賴型蛋白激酶A(cAMP-dependent protein kinase A，PKA)的結(jié)合情況。結(jié)果表明，ZDHHC17僅可以與TrkA結(jié)合。同時免疫熒光檢測結(jié)果表明，抑制ZDHHC17表達(dá)后，表達(dá)TrkA陽性的運(yùn)輸囊泡聚集在細(xì)胞核的核周，其在胞質(zhì)

16、內(nèi)的運(yùn)輸受到抑制，提示ZDHHC17通過促進(jìn)TrkA在胞質(zhì)內(nèi)的運(yùn)輸，調(diào)控下游的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。目前的研究認(rèn)為TrkA在胞質(zhì)內(nèi)通常沿著微管網(wǎng)絡(luò)系統(tǒng)運(yùn)輸，并且可以反作用于微管蛋白(tubulin)，調(diào)節(jié)微管蛋白的動態(tài)平衡。因此我們分別在體內(nèi)體外，利用免疫共沉淀技術(shù)檢測tubulin蛋白與TrkA蛋白的相互作用。結(jié)果表明，抑制ZDHHC17表達(dá)以后，TrkA和tubulin的結(jié)合能力減弱，而過表達(dá)ZDHHC17可以促進(jìn)TrkA和tubulin的相互

17、作用。證明ZDHHC17是通過調(diào)節(jié)TrkA-tubulin復(fù)合物的形成，影響TrkA激酶在胞質(zhì)內(nèi)的運(yùn)輸，導(dǎo)致下游p-ERK表達(dá)水平的變化，繼而調(diào)控神經(jīng)元軸突的生長。
　　最后，為了進(jìn)一步深入研究ZDHHC17促進(jìn)TrkA-tubulin復(fù)合物形成的機(jī)制，我們分析ZDHHC17的蛋白結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)其含有可能與蛋白識別粘附作用有關(guān)的錨蛋白重復(fù)序列，因此，我們構(gòu)建缺失型ZDHHC17蛋白表達(dá)載體(ZDHHC17△ANK)轉(zhuǎn)染NGF誘導(dǎo)的PC