HSL的表達(dá)和活性與豚鼠精子發(fā)生的相關(guān)性研究.pdf

1、一、研究背景與目的 世界衛(wèi)生組織(WHO)預(yù)測(cè)，男性不育癥、癌癥和心血管病癥將成為21世紀(jì)危害人類健康最最嚴(yán)重的三大疾病。最近50年間，全球人類的精子質(zhì)量降低，生殖能力也大大下降。我國(guó)臨床統(tǒng)計(jì)，育齡夫婦中約10％-15％患有不育不孕癥；臺(tái)灣省每10對(duì)夫婦中約有一對(duì)不育；北京協(xié)和醫(yī)院專家對(duì)1980-1990年間診治的萬余例男性不育患者的統(tǒng)計(jì)結(jié)果，發(fā)現(xiàn)就診人數(shù)后5年竟是前5年的2-3倍。在南海市某地，1991-1995年的就診人數(shù)正

2、好比1981-1985年翻了一番。上述情況表明，男性不育癥患者正在全球范圍內(nèi)不斷增多。而在男性不育癥的原因當(dāng)中，精子發(fā)生障礙是其中一個(gè)重要的影響因素。 精子發(fā)生是一種依賴于分泌調(diào)節(jié)的發(fā)育過程，其特征是由未分化的雙倍體干細(xì)胞轉(zhuǎn)變成高度分化的單倍體精子。這一分化過程是在雄性生殖腺(睪丸)的曲細(xì)精管上皮細(xì)胞中進(jìn)行的，并且依賴于支持細(xì)胞(Sertoli)與生精細(xì)胞的緊密接觸，在促黃體激素(corpus luteum-stimulatin

3、g hormone，LH)和促卵泡激素(folliclestimulating hormone，F(xiàn)SH)的作用下Leydig細(xì)胞分泌睪丸激素-睪酮(testosterone，T)作用于Sertoli細(xì)胞，從而刺激基因轉(zhuǎn)錄和生殖細(xì)胞分化。 因此，T、FSH和LH在生精過程中是必需的，尤其T是精子發(fā)生過程中的至關(guān)重要的因素。FSH是啟動(dòng)精子發(fā)生的重要因子。FSH通過環(huán)磷腺苷(cyclicadenosine monomphsopate

4、，cAMP)和鈣離子信號(hào)途徑直接調(diào)節(jié)支持細(xì)胞或生精細(xì)胞。FSH的作用可能是改變支持細(xì)胞的結(jié)構(gòu)及功能，產(chǎn)生有利于精子發(fā)生的條件，從而啟動(dòng)精子發(fā)生。LH作用于Leydig細(xì)胞，每一個(gè)Leydig細(xì)胞有6000個(gè)LH受體，LH與其受體的結(jié)合，Leydig細(xì)胞內(nèi)的c-AMP水平明顯提高，這表明LH能刺激腺苷環(huán)化酶的活性，膜電位(membrane potential，MP)水平升高激活蛋白激酶，促進(jìn)Leydig內(nèi)蛋白質(zhì)磷酸化，激活膽固醇轉(zhuǎn)變?yōu)樵邢?/p>

5、醇酮進(jìn)而增強(qiáng)T的合成。T是精子發(fā)生調(diào)節(jié)中最為重要因素，睪丸中類肌樣細(xì)胞和支持細(xì)胞是它的靶細(xì)胞。T作用于類肌細(xì)胞使之產(chǎn)生支持細(xì)胞調(diào)節(jié)蛋白，最終以T和支持細(xì)胞調(diào)節(jié)蛋白，實(shí)現(xiàn)對(duì)支持細(xì)胞的雙重調(diào)節(jié)。從分子水平看，精子發(fā)生和成熟分化過程是一系列特定基因程序性表達(dá)的過程，其中表達(dá)許多睪丸特異性基因，包括cAMP應(yīng)答元件調(diào)控因子、干細(xì)胞因子(stem cell factor，SCF)、熱休克蛋白(heat shock protein，HSP70)、腫

6、瘤相關(guān)移植抗原(tumour-associated transplantation antigen，TATA)結(jié)合蛋白，EDDY將之統(tǒng)稱為“沙文基因”。在精子的生成過程中，一系列的基因表達(dá)和調(diào)控最終使得生精細(xì)胞表現(xiàn)出體細(xì)胞所沒有的形態(tài)特征和細(xì)胞行為以及特殊的功能。并且生精細(xì)胞的生長(zhǎng)發(fā)育要求非常嚴(yán)格的特殊環(huán)境。目前國(guó)際上主要通過RNA干擾、免疫相關(guān)技術(shù)、構(gòu)建特殊的細(xì)胞系、以及轉(zhuǎn)基因或基因敲除小鼠的方法研究與精子發(fā)生相關(guān)基因，對(duì)其分子基礎(chǔ)有

7、了長(zhǎng)足的認(rèn)識(shí)。 本文的研究是基于激素敏感性脂肪酶(hormone-sensitive lipase，HSL)能調(diào)節(jié)脂肪酸、膽固醇以及類固醇的代謝，膽固醇代謝生成孕烯醇酮從而生成睪酮這一機(jī)制。并且睪酮是促使精子發(fā)生中最重要的因素的之一，且HSL在睪丸中的特異性表達(dá)，從而建立動(dòng)物分組，從分子水平研究HSL在睪酮生成中的作用，以及HSL的表達(dá)及酶活性和精子發(fā)生及成熟的相關(guān)關(guān)系。 二、材料與方法 (一)材料 戊巴比妥

8、鈉、0.9％氯化鈉注射液、Frizol試劑、達(dá)暉RT-PCR反應(yīng)體系、西班牙瓊脂糖、達(dá)安基因?qū)嶒?yàn)伴侶、異丙醇、湘儀離心機(jī)、Eppendof冷凍離心機(jī)、北京六一電泳儀、捷達(dá)801凝膠成像分析系統(tǒng)、ABI9700擴(kuò)增儀、EDTA溶液、buffer液以及激素測(cè)定試劑盒和脂肪酸測(cè)定試劑盒等。 (二)方法 1、將不同年齡階段的豚鼠依據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果分成三組，分別為：6d的幼鼠、16d青春期豚鼠以及70d的成年豚鼠，每組6只；麻醉處死后收集

9、豚鼠的睪丸及附睪組織以及腹腔靜脈血液。 2、對(duì)左側(cè)睪丸、附睪組織進(jìn)行勻漿(分成三部分)，取一部分勻漿用半定量RT-PCR方法檢測(cè)睪丸和附睪組織中HSL的mRNA表達(dá)量，第二部分在37℃下比色法對(duì)HSL酶活性進(jìn)行測(cè)定，第三部分用甘油三酯和膽固醇酯試劑盒對(duì)睪丸勻漿中的膽固醇酯和甘油三酯進(jìn)行測(cè)定。 3、對(duì)抽取的血液進(jìn)行離心，放免法測(cè)定腹腔靜脈血清中睪酮、促黃體生成素、促卵泡激素水平。 4、對(duì)右側(cè)睪丸、附睪組織切片進(jìn)行H

10、E染色，并對(duì)睪丸和附睪組織切片進(jìn)行組織形態(tài)學(xué)分析，觀察有無精子發(fā)生以及組織形態(tài)學(xué)的變化。 5、數(shù)據(jù)處理和統(tǒng)計(jì)方法用SPSS10.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。各年齡組間的HSLmRNA表達(dá)量、血清性激素水平、HSL酶活性、膽固醇酯和甘油三酯進(jìn)行方差分析(ONE-wayANOVA)檢驗(yàn)，兩兩組間比較采用LSD-t檢驗(yàn)，方差不齊時(shí)用Tambane's T2檢驗(yàn)。HSL酶活性和膽固醇酯、甘油三酯以及血清中T、FSH、LH水平之間用Pearson

11、相關(guān)分析。 三、結(jié)果 1、發(fā)育階段的豚鼠隨著年齡的增加，睪丸特異性HSLmRNA表達(dá)70d組與6d和16d組間均具有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.01)，而6d和16d組間沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，其表達(dá)逐漸增強(qiáng)； 2、HSL酶活性逐漸增強(qiáng)，各組間有均顯著性差異(F=145.418，P<0.05)；組間兩兩比較也均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，也呈逐步遞增趨勢(shì)。HSL mRNA與HSL酶活性有明顯的正相關(guān)性。 3、各組間睪丸勻漿中膽固

12、醇酯有明顯差異(F=13.666，P=0.000)，組間兩兩比較，6d和16d以及70d比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.01)，16d組和70d組的比較沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P=0.162)。膽固醇酯的濃度從幼齡到成熟期呈逐步下降趨勢(shì)。而各年齡組間的甘油三酯含量通過方差分析顯示沒有明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(F=2.887，P=0.087)。HSL酶活性與膽固醇酯有明顯的負(fù)相關(guān)性，但不與甘油三酯濃度相關(guān)。 4、血清中T、LH、FSH的水平逐漸升高，各組

13、的T水平有明顯差異(F=197.282，P<0.01)，6d和16d及70d組間的LH水平有明顯差異(P<0.05)，70d和16d組間沒有差異：各組間的FSH水平均有明顯差異(F=5.772，P=0.014)。 HSL的酶活性與T、FSH以及LH之間都有明顯相關(guān)性，并有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。5、組織形態(tài)學(xué)顯示6d的豚鼠睪丸及附睪組織中以精原細(xì)胞為主，未見精子細(xì)胞，16d組織中可見各級(jí)精原細(xì)胞，能見到部分精子細(xì)胞。70d的組織中可見大量的

14、成熟精子細(xì)胞。 四、結(jié)論 1、幼齡豚鼠睪丸及附睪中HSL mRNA表達(dá)和活性都非常低，整個(gè)發(fā)育階段，HSL mRNA及酶活性增長(zhǎng)呈平行趨勢(shì)，HSL的表達(dá)決定了HSL的酶活性。 2、睪丸特異性HSL是豚鼠睪丸中膽固醇酯水解的底物酶，維持了膽固醇酯在睪丸中的濃度，并可能是唯一的底物酶，HSL的酶活性在膽固醇酯降解為睪酮過程中起著非常重要的作用。 3、HSL的表達(dá)與活性的增長(zhǎng)在睪丸附睪組織的發(fā)育成熟中起著非常重