葡萄糖神經(jīng)酰胺合成酶小干擾RNA逆轉(zhuǎn)胃癌多藥耐藥的研究.pdf

1、目的：探討GCS在胃癌多藥耐藥中的作用以及靶向GCS小干擾RNA(small interferingRNA，siRNA)對胃癌耐藥的影響。 方法： 1．常規(guī)培養(yǎng)GES-1、BGC823、SGC7901和SGC7901NCR細(xì)胞。其中SGC7901/VCR細(xì)胞培養(yǎng)液中加入長春新堿(vincristine，VCR)0.5～1.0μg/ml，以維持其相應(yīng)的耐藥表型。于檢測前撤除VCR培養(yǎng)2周。 2．應(yīng)用RT-PCR、免疫組化和

2、Western blot的方法在mRNA水平和蛋白水平上檢測GCS在GES-1、BGC823、SGC7901和SGC7901/VCR細(xì)胞中的表達(dá)。 3．采用四甲基偶氮唑鹽(MTT)光吸收法，檢測胃癌細(xì)胞SGC7901和SGC7901/VCR對化療藥物阿霉素(ADR)、VCR、5-氟脲嘧啶(5-FU)和順鉑(DDP)的敏感性。 4．設(shè)計合成3對針對葡萄糖神經(jīng)酰胺合成酶(GCS)基因編碼的反向重復(fù)序列，并將其定向克隆入真核表

3、達(dá)載體pSUPER EGFP中，構(gòu)建GCS siRNA真核表達(dá)載體R1-pSUPER EGFP、R2-pSUPER EGFP、R3-pSUPER EGFP。 5．將3種GCS siRNA表達(dá)載體分別體外瞬時轉(zhuǎn)染人胃癌耐藥細(xì)胞SGC7901/VCR，應(yīng)用RT-PCR和Western blot方法檢測3種重組質(zhì)粒對轉(zhuǎn)染后細(xì)胞中GCS mRNA和蛋白表達(dá)的影響，并比較其干擾效果，篩選作用強的重組質(zhì)粒進(jìn)行后續(xù)試驗。 6．用干擾效

4、果好的重組質(zhì)粒R1-pSUPER EGFP轉(zhuǎn)染胃癌SGC7901/VCR細(xì)胞，并篩選擴增陽性細(xì)胞，建立穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞系。 7．應(yīng)用MTT光吸收法和生長曲線檢測和反映重組質(zhì)粒R1-pSUPER EGFP轉(zhuǎn)染后對SGC7901/VCR細(xì)胞生長的影響。 8．采用RT-PCR和Western blot方法檢測穩(wěn)定轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒后對胃癌細(xì)胞SGC7901/VCR中GCS、mdrlmRNA和P-gp表達(dá)的影響。 9．采用RT-P

5、CR和免疫組化方法檢測轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒后SGC7901/VCR細(xì)胞中凋亡相關(guān)因子bcl-2、bax、caspase-3的表達(dá)水平；應(yīng)用流式細(xì)胞技術(shù)檢測轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒后SGC7901/VCR細(xì)胞凋亡情況。 10．應(yīng)用MTT法檢測轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒后SGC7901/VCR細(xì)胞對化療藥物ADR、VCR、5-FU和DDP的敏感性。 11．將穩(wěn)定轉(zhuǎn)染GCS重組質(zhì)粒、轉(zhuǎn)染空載體和未轉(zhuǎn)染空白對照細(xì)胞SGC7901/VCR分別注入裸鼠背部皮下，建立

6、裸鼠胃癌移植瘤模型。定期觀察成瘤情況，每6天測量腫瘤大小一次，繪制腫瘤生長曲線。測量腫瘤體積和重量，計算腫瘤抑制率，觀察不同組裸鼠移植瘤的生長情況。 12．應(yīng)用HE染色的方法，觀察瘤體組織結(jié)構(gòu)；RT-PCR和免疫組化方法檢測移植瘤組織中GCS的表達(dá)水平；TUNEL法檢測移植瘤組織細(xì)胞凋亡情況。 13．應(yīng)用SPSS10.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。計量資料數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x±s)表示，兩組均數(shù)的比較用t檢驗，多樣本均數(shù)的

7、比較用方差分析。計數(shù)資料計算陽性率，陽性率之間的比較采用X<'2>檢驗。以α=0.05為檢驗水準(zhǔn)。 結(jié)果： 1．RT-PCR、免疫組化和Western blot結(jié)果表明GCS在GES-1、BGC823、SGC7901和SGC7901/VCR細(xì)胞中均有表達(dá)。RT-PCR結(jié)果顯示，GCS mRNA的相對表達(dá)量GES-1為0.34-0.01，BGC823為0.36±0.02，SGC7901為0.49±0.04，SGC7901N

8、CR為0.98±0.01，GES-1細(xì)胞GCS mRNA表達(dá)水平最低，耐藥細(xì)胞SGC7901/VCR表達(dá)水平最高，顯著高于親本細(xì)胞SGC7901(P<0/05)；免疫組化標(biāo)本上，GCS蛋白陽性表達(dá)呈棕黃色顆粒，位于胞漿內(nèi)，蛋白表達(dá)陽性率以耐藥細(xì)胞SGC7901/VCR最高，明顯高于其它細(xì)胞(P<0.05)；Westernblot分析結(jié)果顯示，各組細(xì)胞在蛋白上樣量相同的條件下，GES-1細(xì)胞GCS蛋白條帶顯色最弱，BGC823其次，SGC

9、7901增強，SGC7901/VCR最重。 2．體外藥物敏感性分析結(jié)果顯示SGC7901/VCR細(xì)胞對ADR、VCR、5-FU和DDP的IC<,50>均高于SGC7901細(xì)胞(P<0.05)。 3．酶切鑒定R1-pSUPER EGFP、R2-pSUPER EGFP、R3-pSUPER EGFP重組質(zhì)粒，結(jié)果顯示雙酶切后可正確釋放出約285bp片段，與質(zhì)粒圖譜資料相符。DNA測序證實，重組質(zhì)粒中插入片段的堿基組成與設(shè)計的D

10、NA序列完全一致，表明成功構(gòu)建了針對GCS基因的siRNA表達(dá)載體。 4．重組質(zhì)粒瞬時轉(zhuǎn)染SGC7901/VCR細(xì)胞后，RT-PCR及Western blot結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染3種重組質(zhì)粒后SGC7901/VCR細(xì)胞中GCS表達(dá)水平的變化程度不同，其中以轉(zhuǎn)染R1-pSUPER EGFP的細(xì)胞中GCS的表達(dá)水平降低最為明顯，轉(zhuǎn)染另外兩種重組質(zhì)粒的細(xì)胞中GCS的表達(dá)水平下降不明顯，說明針對GCS的siRNA載體可以在真核細(xì)胞中表達(dá)，并以R

11、1-pSUPER EGFP所表達(dá)的小干擾RNA對GCS的抑制效果最好。 5．重組質(zhì)粒穩(wěn)定轉(zhuǎn)染SGC7901/VCR細(xì)胞后，生長曲線顯示轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒細(xì)胞與轉(zhuǎn)染空載體和空白對照組相比，細(xì)胞生長曲線上升緩慢，細(xì)胞生長速度減慢。 6．RT-PCR結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒細(xì)胞的GCS mRNA和mdrl mRNA的相對含量明顯低于轉(zhuǎn)染空載體和空白對照組(P<0.05)。Western blot檢測也顯示R1-pSilPER EGFP重

12、組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染能明顯抑制SGC7901/VCR細(xì)胞中GCS蛋白和P-gp的表達(dá)，其抑制率分別為83.5％和74％。 7．穩(wěn)定轉(zhuǎn)染后對凋亡相關(guān)因子檢測結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒細(xì)胞中促凋亡因子baX、caspase-3表達(dá)水平升高，抑凋亡因子bcl-2表達(dá)水平降低，與空載體組和空白對照組細(xì)胞相比，差異顯著(P<0.05)。 8．流式細(xì)胞術(shù)檢測結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒組細(xì)胞凋亡率(33.35±0.11％)顯著高于轉(zhuǎn)染空載體組(5.09±

13、0.02％)和空白對照組(3.98±0.04％)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。 9．MTT檢測細(xì)胞對化療藥物的敏感性結(jié)果顯示，與未轉(zhuǎn)染空白對照細(xì)胞和轉(zhuǎn)染空載體細(xì)胞相比，轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒細(xì)胞對ADR、VCR、5-FU和DDP的IC<,50>減小，耐藥指數(shù)降低，敏感性增高，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。 10．接種重組質(zhì)粒組細(xì)胞裸鼠體內(nèi)成瘤時間延遲，腫瘤體積及重量明顯小于空白對照組和空載體組(P<0.05)，重組質(zhì)粒

14、組裸鼠腫瘤體積抑制率和重量抑制率分別為64.13％和63.81％。組織病理學(xué)檢測顯示，重組質(zhì)粒組腫瘤組織壞死較多。RT-PCR和免疫組化結(jié)果顯示，重組質(zhì)粒組裸鼠腫瘤組織中GCS mRNA和蛋白表達(dá)水平明顯降低，與空白對照組和空載體組相比，差異顯著(P<0.05)。TUNEL檢測結(jié)果顯示，重組質(zhì)粒組裸鼠腫瘤組織細(xì)胞凋亡陽性率顯著高于空白對照組和空載體組(P<0.05)。 結(jié)論： 1．胃癌細(xì)胞中均存在GCS基因的表達(dá)，但不同

15、的細(xì)胞GCS表達(dá)強弱程度不同。耐藥細(xì)胞株中GCS mRNA和蛋白的表達(dá)水平最高，明顯高于親本敏感細(xì)胞，提示GCS參與了胃癌的發(fā)生發(fā)展過程，并與胃癌細(xì)胞的多藥耐藥有關(guān)。 2．成功構(gòu)建了3個GCS siRNA真核表達(dá)載體，其在胃癌耐藥細(xì)胞中對GCS的干擾效果不同，提示重組質(zhì)粒對靶基因的抑制效果與靶序列的結(jié)構(gòu)和位置有關(guān)。通過試驗優(yōu)選出干擾效果最佳者R1-pSUPER EGFP，保證其基因沉默的特異性和高效性，為進(jìn)一步探索靶向封閉GCS

16、對胃癌細(xì)胞多藥耐藥的影響奠定基礎(chǔ)。 3．建立了穩(wěn)定轉(zhuǎn)染GCS siRNA表達(dá)載體的胃癌細(xì)胞系。GCS siRNA載體抑制GCS表達(dá)，同時可下調(diào)m&l的表達(dá)，上調(diào)凋亡相關(guān)因子caspase-3和bax的表達(dá)，誘導(dǎo)耐藥細(xì)胞凋亡增加，使細(xì)胞對化療藥物的敏感性增高。 4．裸鼠體內(nèi)GCS siRNA表達(dá)載體可特異性抑制胃癌耐藥細(xì)胞移植瘤組織中GCS的表達(dá)，誘發(fā)移植瘤細(xì)胞凋亡，抑制移植瘤的生長。提示GCS siRNA表達(dá)載體可能會成