腦膠質(zhì)瘤動(dòng)物模型中血腦屏障緊密連接的變化.pdf

1、腦膠質(zhì)瘤是顱內(nèi)發(fā)病率最高的原發(fā)性腦腫瘤，約占顱內(nèi)腫瘤的40%左右。目前，即使采用手術(shù)、放療、化療等綜合治療，腦膠質(zhì)瘤患者的平均五年生存率常不到30%。盡管近十年來(lái)，人們?cè)谀X膠質(zhì)瘤的基礎(chǔ)與臨床研究方面都取得了很大的進(jìn)步，但腦膠質(zhì)瘤仍是致殘率、致死率最高的惡性腫瘤之一。其中，作為膠質(zhì)瘤最常見(jiàn)類型之一的膠質(zhì)母細(xì)胞瘤（glioblastoma，GBM），其平均生存時(shí)間更在過(guò)去的三十年間無(wú)明顯改善。從疾病的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程來(lái)看，腦膠質(zhì)瘤影響患者生活

2、質(zhì)量及導(dǎo)致患者死亡的原因主要來(lái)自兩個(gè)方面：①腫瘤細(xì)胞本身的惡性增殖；②膠質(zhì)瘤細(xì)胞作用于宿主并導(dǎo)致患者中樞神經(jīng)系統(tǒng)多種病理生理變化及多種癥狀與并發(fā)癥的產(chǎn)生。隨著現(xiàn)代分子生物學(xué)的發(fā)展，人們?cè)谀z質(zhì)瘤細(xì)胞惡性增殖分子機(jī)制方面取得了很大進(jìn)展。但是，膠質(zhì)瘤細(xì)胞如何引起中樞神經(jīng)系統(tǒng)的多種病理生理變化？其分子機(jī)制如何？這是當(dāng)前膠質(zhì)瘤研究中的一個(gè)薄弱環(huán)節(jié)。 眾所周知，血腦屏障是維持中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)，一般認(rèn)為，血腦屏障基本結(jié)構(gòu)包括：

3、腦毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞及其間緊密連接，內(nèi)皮基膜及星形膠質(zhì)細(xì)胞終足形成的膠質(zhì)膜。其中，腦毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞及其間的緊密連接是血腦屏障機(jī)能與結(jié)構(gòu)的主要基礎(chǔ)。近年來(lái)，隨著緊密連接基礎(chǔ)研究所取得的巨大進(jìn)步，人們對(duì)緊密連接的蛋白組成及其生理功能有了嶄新的認(rèn)識(shí)，目前認(rèn)為，緊密連接由一組蛋白分子所構(gòu)成的復(fù)合體。這些分子包括：①跨膜蛋白，主要由claudins，occludins，junction associated molecules（JAM）等蛋白家族

4、構(gòu)成；②胞漿附屬蛋白，主要由zonula occludens（ZO）等蛋白家族構(gòu)成。細(xì)胞膜上這些緊密連接分子元件彼此相互作用并與鄰近細(xì)胞膜上緊密連接蛋白相聚合、促使胞膜局部“融合”進(jìn)而形成冰凍蝕刻電鏡下緊密連接所表現(xiàn)的復(fù)雜三維網(wǎng)狀超微結(jié)構(gòu)。血腦屏障結(jié)構(gòu)與功能的完整對(duì)維持神經(jīng)系統(tǒng)的正常功能至關(guān)重要，同時(shí)，緊密連接結(jié)構(gòu)與功能的變化也是多種神經(jīng)系統(tǒng)疾病病理生理變化的核心過(guò)程。隨著神經(jīng)腫瘤學(xué)的發(fā)展，人們發(fā)現(xiàn)，膠質(zhì)瘤細(xì)胞可以在其發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中對(duì)

5、血腦屏障產(chǎn)生多種作用進(jìn)而導(dǎo)致多種神經(jīng)系統(tǒng)癥狀及并發(fā)癥的產(chǎn)生。 關(guān)于腦膠質(zhì)瘤中血腦屏障的形態(tài)學(xué)改變，許多文獻(xiàn)敘述卻不盡相同。而在膠質(zhì)瘤對(duì)血腦屏障緊密連接的影響方面，不同的學(xué)者也取得了“開(kāi)放”與“完整”的不同研究結(jié)果。為了研究膠質(zhì)瘤細(xì)胞對(duì)血腦屏障的形態(tài)學(xué)改變，本研究通過(guò)建立腦膠質(zhì)瘤動(dòng)物模型，探索了膠質(zhì)瘤細(xì)胞對(duì)血腦屏障的超微結(jié)構(gòu)的影響；同時(shí)，隨著現(xiàn)代分子生物學(xué)與實(shí)驗(yàn)技術(shù)的進(jìn)步，如何從分子水平上闡明膠質(zhì)瘤細(xì)胞對(duì)血腦屏障緊密連接的作用及其

6、病理生理意義已成為神經(jīng)腫瘤學(xué)研究的當(dāng)務(wù)之急。為了研究腦膠質(zhì)瘤血腦屏障緊密連接主要分子元件的表達(dá)變化，從分子水平上闡明膠質(zhì)瘤細(xì)胞對(duì)血腦屏障緊密連接的影響以及其病理生理意義，本研究利用免疫組化及RT-PCR技術(shù)，探索了膠質(zhì)瘤細(xì)胞對(duì)血腦屏障緊密連接分子元件claudins-5的作用及其可能的分子生物學(xué)與病理生理學(xué)機(jī)制。 目的： 1.建立接近人腦膠質(zhì)瘤的血腦屏障體內(nèi)模型，研究血腦屏障的生理及病理生理變化。 2.研究腦膠質(zhì)

7、瘤血腦屏障緊密連接超微結(jié)構(gòu)的變化，為腦膠質(zhì)瘤中血腦屏障的形態(tài)學(xué)改變提供理論基礎(chǔ)。 3.研究腦膠質(zhì)瘤血腦屏障緊密連接主要分子元件的表達(dá)變化，從分子水平上闡明膠質(zhì)瘤細(xì)胞對(duì)血腦屏障緊密連接的影響以及其病理生理意義。 方法： 1.培養(yǎng)C6膠質(zhì)瘤細(xì)胞，通過(guò)立體定向技術(shù)在Wister大鼠右側(cè)尾狀核建立腦膠質(zhì)瘤動(dòng)物模型； 2.腦膠質(zhì)瘤動(dòng)物模型建立21天后，通過(guò)肉眼和運(yùn)用MRI檢查腦膠質(zhì)瘤動(dòng)物模型腫瘤的形成； 3

8、.采用透射電鏡觀察腦膠質(zhì)瘤動(dòng)物模型及正常Wister大鼠血腦屏障緊密連接的超微結(jié)構(gòu)特征； 4.運(yùn)用免疫組織化學(xué)染色觀察腦膠質(zhì)瘤動(dòng)物模型及正常Wister大鼠緊密連接蛋白claudin-5的表達(dá)： 5.采用半定量RT-PCR的方法探索膠質(zhì)瘤細(xì)胞對(duì)血腦屏障內(nèi)皮細(xì)胞緊密連接蛋白分子元件claudin-5表達(dá)的影響。 6.統(tǒng)計(jì)學(xué)分析：采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件包分析。數(shù)據(jù)均以x±s表示，不同部位及正常組claudin-

9、5 mRNA條帶OD值比較采用單向方差分析和多重比較，如果滿足方差齊性采用Fisher方差分析及LSD法進(jìn)行多重比較，若不滿足方差齊性采用近似F檢驗(yàn)Welch法方差分析及Tambanes's T2法進(jìn)行多重比較，以P<0.05為差異有顯著性意義。 結(jié)果： 1.C6腫瘤細(xì)胞接種于Wister大鼠右側(cè)尾狀核21天后，肉眼及MRI可見(jiàn)腦膠質(zhì)瘤動(dòng)物模型右腦形成腫瘤，腫瘤占位效應(yīng)明顯，腫瘤周邊有局部水腫。 2.透射電鏡下，

10、正常Wister大鼠腦組織微血管相鄰內(nèi)皮細(xì)胞間可見(jiàn)連續(xù)條帶狀的緊密連接，細(xì)胞間未見(jiàn)裂隙；在腦膠質(zhì)瘤腫瘤中心組織，僅有22.23%微血管相鄰內(nèi)皮細(xì)胞間可見(jiàn)條帶狀緊密連接，其余內(nèi)皮細(xì)胞間可見(jiàn)明顯裂隙，部分內(nèi)皮細(xì)胞間連接為縫隙連接；在腦膠質(zhì)瘤腫瘤邊緣組織中，有57.15%微血管內(nèi)皮細(xì)胞間存在緊密連接，其余內(nèi)皮細(xì)胞間局部可見(jiàn)裂隙，部分內(nèi)皮細(xì)胞間可見(jiàn)縫隙連接。在腦膠質(zhì)瘤腫瘤遠(yuǎn)隔部位，有95.65%微血管相鄰內(nèi)皮細(xì)胞緊密連接未見(jiàn)破壞，細(xì)胞間緊密連接

11、為連續(xù)條帶狀。距腫瘤中心越遠(yuǎn)，相鄰微血管內(nèi)皮細(xì)胞間緊密連接越完整。 3.膠質(zhì)瘤細(xì)胞作用21天后，免疫組織化學(xué)染色觀察緊密連接蛋白claudin-5的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)正常Wister大鼠腦組織微血管內(nèi)皮細(xì)胞claudin-5呈強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)，而腫瘤中心組織微血管內(nèi)皮細(xì)胞claudin-5表達(dá)呈陰性；腫瘤邊緣微血管內(nèi)皮細(xì)胞claudin-5呈弱陽(yáng)性表達(dá)。 4.RT-PCR結(jié)果顯示腫瘤邊緣和腫瘤中心claudin-5表達(dá)明顯減少，與正常

12、腦組織相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.000，P=0.000），腫瘤遠(yuǎn)隔部位claudin-5表達(dá)也減少，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.960）。 結(jié)論： 1.通過(guò)立體定向技術(shù)可以成功在Wister大鼠右側(cè)尾狀核建立C6腦膠質(zhì)瘤動(dòng)物模型，并且通過(guò)MRI可見(jiàn)腫瘤占位效應(yīng)明顯，局部形成水腫帶。 2.膠質(zhì)瘤細(xì)胞在其發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中可破壞血腦屏障內(nèi)皮細(xì)胞間緊密連接超微結(jié)構(gòu)。 3.在C6腦膠質(zhì)瘤動(dòng)物模型不同位置的腦組