膠質(zhì)瘤干細(xì)胞誘發(fā)腫瘤免疫炎性微環(huán)境相關(guān)動(dòng)物模型的研究.pdf

1、背景與目的：腫瘤微環(huán)境是指腫瘤細(xì)胞與宿主組織和細(xì)胞之間形成的相生相克的微生態(tài)環(huán)境。盡管近年有關(guān)腫瘤微環(huán)境的研究進(jìn)展迅速，但所得數(shù)據(jù)受倫理學(xué)限止，仍然主要來源于實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型而非人體，因此搭建模擬性高的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型平臺(tái)還是腫瘤學(xué)研究者十分關(guān)注的重要問題。就腫瘤免疫炎性微環(huán)境而言，建立人腫瘤動(dòng)物模型的要求比建立普通動(dòng)物模型的要求更高，必須能確切地反映出那些被腫瘤細(xì)胞重構(gòu)的腫瘤組織和腫瘤邊緣的宿主源性免疫炎性細(xì)胞的來龍去脈，最好還要搞清楚這些細(xì)

2、胞在腫瘤發(fā)生發(fā)展中所起的相生相克作用?；谏鲜鲈颍疚闹荚诒菊n題組早先建立表達(dá)紅色熒光蛋白（RFP）的人腦膠質(zhì)瘤干細(xì)胞和表達(dá)綠色熒光蛋白（GFP）的裸小鼠（RFP+/GFP+雙色熒光示蹤）模型的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步探討膠質(zhì)瘤干細(xì)胞誘發(fā)腫瘤免疫炎性微環(huán)境的相關(guān)問題，尤其是高壓氧如何改變腫瘤微環(huán)境的一些情況。
　　材料與方法：接種用的人腦膠質(zhì)瘤干細(xì)胞SU3和轉(zhuǎn)RFP基因的SU3-RFP，表達(dá)綠色熒光蛋白的NC和Balbc裸小鼠，接種腫瘤細(xì)

3、胞用的套管針和維持SPF級(jí)的高壓氧治療系統(tǒng)-HBOT/IVC都是本課題組研制的。接種腫瘤細(xì)胞的方法，根據(jù)接種部位的不同而有差別，若是腦內(nèi)原位接種，則借助立體定向儀，經(jīng)鉆顱孔緩慢注射；若是皮下接種，則用套管針將腫瘤組織塊或用青霉素皮試注射器將腫瘤細(xì)胞混懸液注入前肢腋下或足掌；若是肝臟接種，則須右肋緣切開，將腫瘤細(xì)胞通過微量泵緩慢注入肝組織內(nèi)；若是腹腔接種，用青霉素皮試注射器將腫瘤細(xì)胞直接推注入腹腔即可。至于接種腫瘤細(xì)胞的量，根據(jù)接種部位和

4、實(shí)驗(yàn)需要觀察的指標(biāo)而定，若是皮下接種腫瘤組織塊，一般用1-3 mm3，細(xì)胞混懸液為106-107個(gè)細(xì)胞/0.5 ml培養(yǎng)液；若是腦和肝內(nèi)接種，一般用細(xì)胞混懸液105個(gè)細(xì)胞/10-15μl培養(yǎng)液。
　　至于腫瘤免疫炎性微環(huán)境觀察,都需取移植瘤,必要時(shí)還要包括腫瘤邊緣組織做冰凍切片和常規(guī)石蠟切片后在白光和熒光顯微鏡下觀察表達(dá)GFP的細(xì)胞分布,通過IPPs6.0軟件量化分析其表達(dá)。若要鑒定在腫瘤及邊緣組織顯示GFP細(xì)胞中的免疫炎性細(xì)胞比

5、例,則必須要用免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)這些細(xì)胞固有的標(biāo)志蛋白。當(dāng)然,也可通過組織消化后的混懸液用流式細(xì)胞儀進(jìn)行測(cè)定比例,或采用分離收集培養(yǎng)等方法隨實(shí)驗(yàn)?zāi)康牟煌右赃x擇。
　　為了觀察高壓氧對(duì)腫瘤的影響，將皮下接種SU3的裸小鼠放置在HBOT/IVC裝置內(nèi)進(jìn)行高壓氧治療，每天一次，每次100分鐘，連續(xù)21天，而單獨(dú)化療藥ACNU組小鼠給予腹腔注射ACNU30 mg/kg，每周一次,共3次，實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)取出腫瘤組織后進(jìn)行稱重。用微電極測(cè)定

6、腫瘤組織內(nèi)的氧含量。
　　結(jié)果與分析：在腦內(nèi)移植瘤組織中，光鏡下可見腫瘤組織出血、壞死和血管增生，腫瘤細(xì)胞呈侵襲性生長(zhǎng)的惡性表型。在熒光顯微鏡下，能清楚地可見發(fā)紅色熒光的腫瘤細(xì)胞、發(fā)綠色熒光的宿主細(xì)胞和RFP/GFP雙陽性的黃色細(xì)胞，在腫瘤壞死灶中和腫瘤邊緣見有大量綠色的炎性細(xì)胞浸潤。
　　在皮下移植瘤組織中，可見腫瘤微環(huán)境相關(guān)蛋白和宿主髓源性抑制細(xì)胞（myeloid-derived suppressor cells，MDS

7、C）的標(biāo)記物包括HIF-1α、TNF-α、Ki67、CD68和CD11b的高表達(dá)，在移植瘤間質(zhì)中，也可見有較多的GFP+、CD68+和CD11b+細(xì)胞。移植瘤經(jīng)高壓氧治療后，腫瘤重量減輕，尤其與化療藥ACNU合用的腫瘤重量更輕。
　　在腹腔移植瘤組織的病理切片上，熒光顯微鏡下可見腫瘤結(jié)節(jié)中包含了RFP+紅色細(xì)胞、GFP+綠色細(xì)胞及RFP+/GFP+的黃色細(xì)胞。在將腫瘤結(jié)節(jié)再培養(yǎng)后，GFP+細(xì)胞可惡性轉(zhuǎn)化為高表達(dá)CD68的癌細(xì)胞。<

8、br>　　在足掌移植瘤近心端的腫瘤邊緣組織，光鏡下可見到腫瘤細(xì)胞核深染，異形性明顯，核分裂常見，細(xì)胞排列密集，而在熒光鏡下清晰地可見移植瘤組織中存在來源于循環(huán)血液的免疫炎性細(xì)胞。
　　在肝移植瘤組織中，光鏡下可見SU3細(xì)胞在異位的肝組織內(nèi)排列密集，核大、深染，并向周圍正常肝組織侵襲生長(zhǎng)。熒光鏡下可見有綠色宿主細(xì)胞與紅色腫瘤細(xì)胞的交織存在，其中包括腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞(tumor-associated macrophages，TAM)。

9、共聚焦顯微鏡下可進(jìn)一步清楚地看到這兩類細(xì)胞發(fā)生融合或吞噬的黃色細(xì)胞。經(jīng)流式細(xì)胞儀檢測(cè)到的紅、綠和黃色細(xì)胞分別為73.65％、19.56%和6.79%。這些黃色細(xì)胞單克隆化后獲得具有無限增殖能力的B4、B9和B10細(xì)胞，B4細(xì)胞可表達(dá)RFP/GFP，而B9和B10細(xì)胞僅表達(dá)GFP。B4細(xì)胞還表達(dá)CD1a、CD83和CD86等樹突狀細(xì)胞的分子標(biāo)記蛋白，B9和B10細(xì)胞可分別表達(dá)CD68、F4/80和FAP-α、α-SMA、S100等巨噬細(xì)胞

10、和成纖維細(xì)胞的分子標(biāo)記蛋白，經(jīng)病理診斷它們均為惡性腫瘤細(xì)胞。
　　采用微電極測(cè)得移植瘤組織中氧含量，在常態(tài)下的頭皮下移植瘤中的平均氧含量為（28.93±8.06）mmol/L，腦內(nèi)移植瘤的平均氧含量為（47.46±15.96）mmol/L。經(jīng)HBO治療后，腦內(nèi)移植瘤在治療出窗時(shí)的平均氧含量增加為（86.61±10.91）mmol/L，與前者相比有顯著差異（P<0.01）。HBO治療后的免疫炎性細(xì)胞明顯減少。
　　結(jié)論：(1)

11、本課題組所建的RFP+/GFP+雙色熒光分別示蹤人腦膠質(zhì)瘤干細(xì)胞和宿主組織細(xì)胞的模型,與傳統(tǒng)人腦膠質(zhì)瘤干細(xì)胞移植普通裸小鼠模型相比,其獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)除了依賴熒光顯微鏡就可以區(qū)別出腫瘤微環(huán)境中哪些是腫瘤細(xì)胞,哪些是腫瘤間質(zhì)細(xì)胞外,還能界定出RFP+/GFP+共定位在一個(gè)細(xì)胞上的黃色細(xì)胞，即是腫瘤細(xì)胞與宿主細(xì)胞發(fā)生了融合的細(xì)胞；(2)基于腫瘤免疫炎性反應(yīng)是腫瘤局部的全身性反應(yīng),而且參與反應(yīng)的細(xì)胞,主要來自骨髓中的髓源性抑制細(xì)胞,因此腫瘤細(xì)胞接種