膠質瘤干細胞誘發(fā)腫瘤免疫炎性微環(huán)境相關動物模型的研究.pdf

1、背景與目的：腫瘤微環(huán)境是指腫瘤細胞與宿主組織和細胞之間形成的相生相克的微生態(tài)環(huán)境。盡管近年有關腫瘤微環(huán)境的研究進展迅速，但所得數(shù)據(jù)受倫理學限止，仍然主要來源于實驗動物模型而非人體，因此搭建模擬性高的實驗動物模型平臺還是腫瘤學研究者十分關注的重要問題。就腫瘤免疫炎性微環(huán)境而言，建立人腫瘤動物模型的要求比建立普通動物模型的要求更高，必須能確切地反映出那些被腫瘤細胞重構的腫瘤組織和腫瘤邊緣的宿主源性免疫炎性細胞的來龍去脈，最好還要搞清楚這些細

2、胞在腫瘤發(fā)生發(fā)展中所起的相生相克作用?；谏鲜鲈?，本文旨在本課題組早先建立表達紅色熒光蛋白（RFP）的人腦膠質瘤干細胞和表達綠色熒光蛋白（GFP）的裸小鼠（RFP+/GFP+雙色熒光示蹤）模型的基礎上，進一步探討膠質瘤干細胞誘發(fā)腫瘤免疫炎性微環(huán)境的相關問題，尤其是高壓氧如何改變腫瘤微環(huán)境的一些情況。
　　材料與方法：接種用的人腦膠質瘤干細胞SU3和轉RFP基因的SU3-RFP，表達綠色熒光蛋白的NC和Balbc裸小鼠，接種腫瘤細

3、胞用的套管針和維持SPF級的高壓氧治療系統(tǒng)-HBOT/IVC都是本課題組研制的。接種腫瘤細胞的方法，根據(jù)接種部位的不同而有差別，若是腦內原位接種，則借助立體定向儀，經(jīng)鉆顱孔緩慢注射；若是皮下接種，則用套管針將腫瘤組織塊或用青霉素皮試注射器將腫瘤細胞混懸液注入前肢腋下或足掌；若是肝臟接種，則須右肋緣切開，將腫瘤細胞通過微量泵緩慢注入肝組織內；若是腹腔接種，用青霉素皮試注射器將腫瘤細胞直接推注入腹腔即可。至于接種腫瘤細胞的量，根據(jù)接種部位和

4、實驗需要觀察的指標而定，若是皮下接種腫瘤組織塊，一般用1-3 mm3，細胞混懸液為106-107個細胞/0.5 ml培養(yǎng)液；若是腦和肝內接種，一般用細胞混懸液105個細胞/10-15μl培養(yǎng)液。
　　至于腫瘤免疫炎性微環(huán)境觀察,都需取移植瘤,必要時還要包括腫瘤邊緣組織做冰凍切片和常規(guī)石蠟切片后在白光和熒光顯微鏡下觀察表達GFP的細胞分布,通過IPPs6.0軟件量化分析其表達。若要鑒定在腫瘤及邊緣組織顯示GFP細胞中的免疫炎性細胞比

5、例,則必須要用免疫組織化學方法檢測這些細胞固有的標志蛋白。當然,也可通過組織消化后的混懸液用流式細胞儀進行測定比例,或采用分離收集培養(yǎng)等方法隨實驗目的不同而加以選擇。
　　為了觀察高壓氧對腫瘤的影響，將皮下接種SU3的裸小鼠放置在HBOT/IVC裝置內進行高壓氧治療，每天一次，每次100分鐘，連續(xù)21天，而單獨化療藥ACNU組小鼠給予腹腔注射ACNU30 mg/kg，每周一次,共3次，實驗結束時取出腫瘤組織后進行稱重。用微電極測定

6、腫瘤組織內的氧含量。
　　結果與分析：在腦內移植瘤組織中，光鏡下可見腫瘤組織出血、壞死和血管增生，腫瘤細胞呈侵襲性生長的惡性表型。在熒光顯微鏡下，能清楚地可見發(fā)紅色熒光的腫瘤細胞、發(fā)綠色熒光的宿主細胞和RFP/GFP雙陽性的黃色細胞，在腫瘤壞死灶中和腫瘤邊緣見有大量綠色的炎性細胞浸潤。
　　在皮下移植瘤組織中，可見腫瘤微環(huán)境相關蛋白和宿主髓源性抑制細胞（myeloid-derived suppressor cells，MDS

7、C）的標記物包括HIF-1α、TNF-α、Ki67、CD68和CD11b的高表達，在移植瘤間質中，也可見有較多的GFP+、CD68+和CD11b+細胞。移植瘤經(jīng)高壓氧治療后，腫瘤重量減輕，尤其與化療藥ACNU合用的腫瘤重量更輕。
　　在腹腔移植瘤組織的病理切片上，熒光顯微鏡下可見腫瘤結節(jié)中包含了RFP+紅色細胞、GFP+綠色細胞及RFP+/GFP+的黃色細胞。在將腫瘤結節(jié)再培養(yǎng)后，GFP+細胞可惡性轉化為高表達CD68的癌細胞。<

8、br>　　在足掌移植瘤近心端的腫瘤邊緣組織，光鏡下可見到腫瘤細胞核深染，異形性明顯，核分裂常見，細胞排列密集，而在熒光鏡下清晰地可見移植瘤組織中存在來源于循環(huán)血液的免疫炎性細胞。
　　在肝移植瘤組織中，光鏡下可見SU3細胞在異位的肝組織內排列密集，核大、深染，并向周圍正常肝組織侵襲生長。熒光鏡下可見有綠色宿主細胞與紅色腫瘤細胞的交織存在，其中包括腫瘤相關巨噬細胞(tumor-associated macrophages，TAM)。

9、共聚焦顯微鏡下可進一步清楚地看到這兩類細胞發(fā)生融合或吞噬的黃色細胞。經(jīng)流式細胞儀檢測到的紅、綠和黃色細胞分別為73.65％、19.56%和6.79%。這些黃色細胞單克隆化后獲得具有無限增殖能力的B4、B9和B10細胞，B4細胞可表達RFP/GFP，而B9和B10細胞僅表達GFP。B4細胞還表達CD1a、CD83和CD86等樹突狀細胞的分子標記蛋白，B9和B10細胞可分別表達CD68、F4/80和FAP-α、α-SMA、S100等巨噬細胞

10、和成纖維細胞的分子標記蛋白，經(jīng)病理診斷它們均為惡性腫瘤細胞。
　　采用微電極測得移植瘤組織中氧含量，在常態(tài)下的頭皮下移植瘤中的平均氧含量為（28.93±8.06）mmol/L，腦內移植瘤的平均氧含量為（47.46±15.96）mmol/L。經(jīng)HBO治療后，腦內移植瘤在治療出窗時的平均氧含量增加為（86.61±10.91）mmol/L，與前者相比有顯著差異（P<0.01）。HBO治療后的免疫炎性細胞明顯減少。
　　結論：(1)

11、本課題組所建的RFP+/GFP+雙色熒光分別示蹤人腦膠質瘤干細胞和宿主組織細胞的模型,與傳統(tǒng)人腦膠質瘤干細胞移植普通裸小鼠模型相比,其獨特的優(yōu)勢除了依賴熒光顯微鏡就可以區(qū)別出腫瘤微環(huán)境中哪些是腫瘤細胞,哪些是腫瘤間質細胞外,還能界定出RFP+/GFP+共定位在一個細胞上的黃色細胞，即是腫瘤細胞與宿主細胞發(fā)生了融合的細胞；(2)基于腫瘤免疫炎性反應是腫瘤局部的全身性反應,而且參與反應的細胞,主要來自骨髓中的髓源性抑制細胞,因此腫瘤細胞接種