類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎和強(qiáng)直性脊柱炎的免疫遺傳學(xué)研究.pdf

1、類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎（RheumatoidArthritis,RA）和強(qiáng)直性脊柱炎（Ankylosing Spondylitis,AS）是我國(guó)最常見(jiàn)的炎性關(guān)節(jié)炎疾病，其患病率高，致殘率高。這兩種疾病的發(fā)病機(jī)制仍不清，但已知其發(fā)病與遺傳密切相關(guān)，且遺傳模式存在種族差異。本課題以RA和AS的易感基因位點(diǎn)入手，圍繞挖掘其致病機(jī)理這一核心環(huán)節(jié)，通過(guò)各種高通量基因分型、深度測(cè)序手段，結(jié)合遺傳流行病學(xué)分析方法，進(jìn)行原創(chuàng)性、以及跨種族遺傳分析比較，對(duì)漢族人群

2、RA和AS的遺傳模式、遺傳特點(diǎn)進(jìn)行研究，從而揭示中國(guó)漢族人AS和RA的遺傳免疫學(xué)發(fā)病機(jī)制:（一）鑒于在 RA研究領(lǐng)域尚無(wú)中國(guó)人群大規(guī)模的遺傳流行病學(xué)研究成果，進(jìn)行了首次漢族人RA大規(guī)模的全基因組關(guān)聯(lián)研究，鑒定了漢族人RA的特有基因DPP4，同時(shí)進(jìn)行了CCP陽(yáng)性與CCP陰性RA病人易感基因的比較分析，以及白種人與漢族人RA遺傳基因的比較分析。豐富了研究者對(duì)RA發(fā)病易感基因及遺傳模式的認(rèn)識(shí)。（二）在AS研究領(lǐng)域，基于歐洲人、漢族人大規(guī)模全基

3、因組關(guān)聯(lián)研究的工作基礎(chǔ)，針對(duì)發(fā)病核心易感基因IL23R在不同種族中存在較明顯的遺傳差異的情況，利用進(jìn)行深度測(cè)序研究手段，發(fā)現(xiàn)了IL23R基因存在罕見(jiàn)變異與發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)，使得對(duì)AS致病機(jī)理的研究有了更新認(rèn)識(shí)。（三）以優(yōu)化漢族人全基因組關(guān)聯(lián)研究的平臺(tái)為目的，比較在常用全基因分析的兩個(gè)平臺(tái)Illumina和Affymetrix中檢測(cè)漢族人遺傳變異的性能，從而為漢族人中進(jìn)行大規(guī)模遺傳研究提供了方法學(xué)參考。
　　目的：進(jìn)行漢族RA患者的大規(guī)

4、模全基因組關(guān)聯(lián)研究，比較與歐洲RA患者遺傳模式的差異；篩選漢族強(qiáng)直性脊柱炎（Ankylosing spondylitis,AS）AS患者與AS相關(guān)的白介素23受體（IL-23 receptor，IL23R）基因罕見(jiàn)突變。比較GWAS分型平臺(tái)Illumina OmniExpress和Affymetrix6.0差異；
　　方法：研究對(duì)象為來(lái)自中國(guó)上海和北京等省級(jí)城市醫(yī)院的無(wú)關(guān)聯(lián)門(mén)診病人，AS或RA由風(fēng)濕病?？漆t(yī)生進(jìn)行診斷確定，對(duì)照為來(lái)

5、自上海血庫(kù)的相應(yīng)的健康獻(xiàn)血人群。應(yīng)用GWAS技術(shù)從2132個(gè)病例和2553個(gè)對(duì)照中篩選了952個(gè)病例、943個(gè)對(duì)照和32個(gè)變異。應(yīng)用MACH通過(guò)兩步法應(yīng)用1000基因組計(jì)劃推算SNP數(shù)據(jù)，其中原始數(shù)據(jù)作為第一步，然后再推算頻率信息中。應(yīng)用GRAIL技術(shù)探尋新基因之間以及與已知基因之間的關(guān)聯(lián)關(guān)系。應(yīng)用GCTA技術(shù)估算RA易感突變的比例?？缛巳篗eta分析技術(shù)用于比較兩個(gè)遠(yuǎn)距離遺傳隔離的漢族人和歐洲人的RA遺傳結(jié)構(gòu)差異。AS研究中，應(yīng)用靶向

6、高通量測(cè)序技術(shù)進(jìn)行測(cè)序。應(yīng)用Taq-Man OpenArray平臺(tái)進(jìn)行基因分型，用Applied Biosystems OpenArray SNP基因分型軟件驗(yàn)證。對(duì)50個(gè)AS病例和59個(gè)種族匹配的健康漢族人的包含IL23R基因區(qū)和鄰近區(qū)域的170kb進(jìn)行測(cè)序。另外，對(duì)650個(gè)AS病例和1300個(gè)健康對(duì)照的，在歐洲人中高相關(guān)的30kb區(qū)域也進(jìn)行測(cè)序。用846個(gè)病例和1308個(gè)健康對(duì)照進(jìn)行基因分型驗(yàn)證。應(yīng)用Illumina OmniExp

7、ress和Affymetrix6.0平臺(tái)對(duì)非HapMap（Non-HapMap）漢族人(n=396)進(jìn)行基因分型，用Immunochip對(duì)子集進(jìn)行基因分型。Illumina OmniExpress和Affymetrix6.0平臺(tái)獲得的基因型標(biāo)記用于基于HapMap2 JPT(日本東京的日本人）+CHB（中國(guó)北京的漢族人)基因數(shù)據(jù)庫(kù)的基因推算。應(yīng)用Illumina's Bead Studio軟件進(jìn)行基因型聚類。從樣本中分析得出SNPs，其

8、中的低質(zhì)量樣本被剔除。得到的SNPs類集進(jìn)行手工檢索和驗(yàn)證。PLINK version1.07軟件的合并模式7的合并功能用于基因分析的符合性分析，它可以比較不計(jì)缺失基因型時(shí)的符合性。
　　結(jié)果：全基因組水平篩選到3個(gè)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異的non-MHC（non-major histocompatibility complex，非主要組織相容性復(fù)合體）位點(diǎn)，且抗瓜氨酸蛋白抗體（anti-citrullinated peptide antib

9、ody，ACPA）陽(yáng)性病例（ACPA+）中的該位點(diǎn)比ACPA陰性病例（ACPA-）效應(yīng)值要大。其中，有2個(gè)是新的突變子，rs12617656，位于二肽基肽酶（dipeptidyl-peptidase4，4DPP4）基因內(nèi)含子區(qū)，優(yōu)勢(shì)比（odds ratio，OR）=1.56，P=1.6×10-21；rs12379034，位于CDK5調(diào)節(jié)亞基相關(guān)蛋白2（CDK5 regulatory subunit associated protein2

10、，CDK5RAP2）基因編碼區(qū)，OR=1.49，P=1.1×10-16；另一個(gè)是已知的人趨化因子受體6（Human chemokine receptor6，CCR6）位點(diǎn)（rs1854853，OR=0.71，P=6.5×10-15）。ACPA-病例與ACPA-對(duì)照研究顯示，rs12617656與APCA強(qiáng)關(guān)聯(lián)(P=5.3×10-18)，與主要組織相容性復(fù)合體（major histocompatibility complex，MHC）位點(diǎn)

11、關(guān)聯(lián)性也很強(qiáng)(rs7748270,P=5.9×10-8)?？缛巳篗eta分析顯示關(guān)聯(lián)信號(hào)區(qū)的重疊和富集。對(duì)3個(gè)分型平臺(tái)進(jìn)行比較，Affymetrix和Illumina平臺(tái)包括Immunochip的符合性很高。OmniExpress和Affymetrix6.0的推算能力有差異，而且MACH的推算效率與先前的報(bào)道相比總體偏低很多，但OmniExpress平臺(tái)可推算更多的SNPs，其最小等位基因頻率（minor allele frequenc

12、y，MAF）是5％。OmniExpress平臺(tái)比Affymetrix6.0平臺(tái)有更高的HapMap SNPs覆蓋率（各為73.6%和65.9%，MAF=5%）。Affymetrix6.0芯片的推算數(shù)據(jù)與OmniExpress或Illumino芯片的比較時(shí)的錯(cuò)誤率比OmniExpress的基因型推算與直接分型的Affymetrix6.0或Illumino芯片SNPs比較時(shí)的錯(cuò)誤率略大。低MAF幾乎對(duì)R2評(píng)估的推算質(zhì)量或符合性沒(méi)有影響，說(shuō)明

13、這些GWAS芯片雖然不是特異設(shè)計(jì)用來(lái)捕獲罕見(jiàn)變異，但是實(shí)際上也可以捕獲有意義的部分低頻變異的遺傳突變。本研究鑒別了1047個(gè)突變，其中729個(gè)未出現(xiàn)在dbSNP genomic build130數(shù)據(jù)庫(kù)中。鑒別了若干有潛在功能的罕見(jiàn)IL23R基因突變，包括1非同義替換SNP（nonsynonomous single-nucleotide polymorphism，nsSNP），Gly149Arg（1號(hào)染色體，位置：67421184GA）。

14、驗(yàn)證基因分型顯示Gly149Arg與AS相關(guān)（OR=0.61，P=0.0054），且預(yù)測(cè)算法發(fā)現(xiàn)這個(gè)氨基酸的變化會(huì)破壞蛋白的功能。與AS相關(guān)的IL23RGly149Arg突變參與了漢族人AS易感的IL-23信號(hào)通路，IL23R與先前發(fā)現(xiàn)的STAT3結(jié)合構(gòu)成IL-23的新的信號(hào)通路。
　　結(jié)論：本研究拓展了RA的風(fēng)險(xiǎn)等位基因列表，證實(shí)DPP4和CDK5RAP2與RA存在遺傳關(guān)聯(lián)，且CDK5RAP2是一個(gè)與RA相關(guān)的重要的不同于TRA

15、F1-C5的新的基因位點(diǎn)，提示不同人群中新型多基因復(fù)雜性狀變異的本質(zhì)實(shí)際上都是由常見(jiàn)的偶發(fā)變驅(qū)動(dòng)的，這為研究RA發(fā)病機(jī)理提供了新的途徑，為常見(jiàn)基因變異驅(qū)動(dòng)的新型多基因復(fù)雜特性增加了實(shí)踐證據(jù)。首次提出與AS發(fā)病機(jī)理相關(guān)的IL23R基因突變，并鑒定了一個(gè)低頻的nsSNP，該突變可能導(dǎo)致IL23R失能，從而對(duì)漢族人AS具有保護(hù)效應(yīng)。這提示功能下降的IL23R可預(yù)防AS。這個(gè)發(fā)現(xiàn)進(jìn)而支持IL-23信號(hào)在AS發(fā)病過(guò)程中中起重要作用，這提示IL-2

16、3信號(hào)通路這條通路可作為AS潛在的治療靶點(diǎn)。本研究還發(fā)現(xiàn)進(jìn)行深度測(cè)序有助于鑒別與復(fù)雜疾病易感性相關(guān)的罕見(jiàn)或低頻突變，同時(shí)這種技術(shù)方法也有助于候選基因偶發(fā)突變的精確定位。Illumina OmniExpress和Affymetrix6.0平臺(tái)有相似的基因分型準(zhǔn)確性和相似的推算SNPs準(zhǔn)確性。雖然OmniExpress平臺(tái)的HapMap SNPs覆蓋率中等，但是對(duì)亞洲人來(lái)說(shuō)，它能提供覆蓋率更好一些。研究也提示只要有適當(dāng)?shù)馁|(zhì)量控制，不管是Af