急性肝壞死時腸道SIgA變化機制的研究.pdf

1、目的：腸屏障可防止腸道內(nèi)寄生菌、毒素等經(jīng)腸壁到達腸外，它由腸道機械屏障、微生物屏障、免疫屏障、化學屏障組成。腸道免疫屏障主要由腸道M細胞、腸上皮內(nèi)淋巴細胞(iIEL)、固有層淋巴細胞、分泌性IgA(SIgA)等組成。SIgA通過抑制細菌或病毒黏附在腸上皮表面，阻止細菌穿入腸道屏障。因此，腸道內(nèi)SIgA存在狀態(tài)影響腸道免疫屏障功能。在探討肝壞死自發(fā)性腹膜炎(SBP)發(fā)生機制時，研究腸道SIgA變化至關重要。本研究對重型肝炎臨床患者腸道SI

2、gA進行檢測，并建立急性肝壞死動物模型和體外培養(yǎng)腸上皮細胞，觀察腸道IgA、SIgA和SC變化情況以及TNF-α和NO對腸上皮細胞分泌SC的影響，以探討在急性肝壞死時腸道免疫屏障的變化，從而研究SBP發(fā)生機制。 材料和方法：1.對象1.1臨床患者：30例重型肝炎病例為2004-2005年中國醫(yī)科大學附屬第二醫(yī)院感染科入院患者，20例重型肝炎死亡病例的腸、肝組織由北京佑安醫(yī)院和第三軍醫(yī)大學西南醫(yī)院提供。 1.2動物模型：采

3、用雄性Balb/C小鼠390只，隨機分為八個組，即：1組：生理鹽水組，2組：LPS，3組：D-GalN，4組：LPS+D-GalN，5組：D-GalN+TNF-α，6組：D-GalN+LPS+TNF-α抗體，7組：TNF-α，8組：D-GalN+LPS+TNF-R1抗體，除6、8組外每組分5個時間點(2h、6h、9h、12h和24h)，第6、8組以9h為時間點。分別取肝和腸等標本待檢。 2.方法2.1分別用免疫散射比濁法和放射免

4、疫方法檢測重型肝炎患者血清和糞便中IgA、SIgA的含量。 2.2免疫組化方法檢測重型肝炎患者腸、肝組織內(nèi)IgA、SC(SIgA)的表達。 2.3雙免疫熒光染色檢測重型肝炎患者腸上皮細胞漿、膜上SIgA的表達。 2.4建立ELISA方法檢測急性肝壞死動物模型血清、糞便IgA的含量。 2.5用放射免疫方法檢測急性肝壞死動物模型糞便SIgA的含量。 2.6免疫組化方法檢測急性肝壞死動物模型腸道IgA的

5、分布和表達。 2.7實時定量PCR(real-timequantitativePCR)檢測小鼠腸組織SCmRNA的相對含量 2.8利用免疫組化、Weasternblot、Real-timePCR方法檢測TNF-α和NO對Caco-2細胞分泌SC的影響。 結(jié)果1.重型肝炎患者血清和糞便中IgA和SIgA較正常對照組明顯升高(P＜0.01)。 2.免疫組化檢測重型肝炎患者腸道SC和IgA：重型肝炎腸組織SC染

6、色較正常腸組織明顯減弱，甚至難見，IgA染色也明顯減弱。腸道SC、IgA免疫組化光密度分析顯示重肝患者腸組織SC、IgA較正常對照組明顯降低(P＜0.01)。 3.腸道雙免疫熒光染色顯示正常腸組織腸上皮細胞漿(分泌的SC)呈橘紅色，膜上SIgA呈黃色，固有層活化淋巴細胞呈橘紅色或黃色；重型肝炎腸組織腸上皮細胞漿、膜染色均明顯減弱。 4.LPS/GalN引起的肝壞死小鼠糞便SIgA含量升高與NS組相比均有顯著差異(P＜0.

7、01)，在9h達到高峰。糞便、血清IgA6h開始升高，維持到24h，與NS組比較有顯著意義(P＜0.01)。 5.LPS引起的肝壞死小鼠腸道IgA免疫組化染色：IgA染色急性肝壞死腸組織較正常腸組織陽性明顯減弱。IgA的光密度注射LPS+GalN后在2h開始下降，維持到12h，與NS組相比有顯著意義(P＜0.01)。 6.LPS/GalN引起的肝壞死小鼠腸組織SCmRNA的表達：LPS引起的肝壞死小鼠在2hSCmRNA的

8、表達量開始下降，9h達到最低，與NS組均有顯著差異(P＜0.01)。 7.由TNF-α/GalN引起的急性肝壞死動物變化和死亡率與LPS/GalN類似，肝組織和腸組織病變與LPS/GalN相同，隨時間逐漸加重，說明TNF-α是急性肝壞死的重要介質(zhì)。 8.由TNF-α/GalN引起的急性肝壞死動物腸道免疫組化結(jié)果：IgA染色可見NS組、抗TNF-IgG組、抗TNF-R1組腸組織腸上皮細胞漿、膜和固有層活化淋巴細胞呈棕黃色強

9、陽性，由TNF-α/GalN引起的急性肝壞死腸組織腸上皮細胞漿陽性明顯減弱。IgA的光密度注射TNF-α+GalN后在2h開始下降，6h達最低維持到12h，與NS組相比有顯著意義(P＜0.01)，這更證明TNF-α是急性肝壞死的重要介質(zhì)。 9.由TNF-α/GalN誘導的肝壞死小鼠腸組織SCmRNA的表達：TNF-α肝壞死組中，2h、6h、9hSCmRNA的表達量均下降，9h達到最低，與NS組亦有顯著差異(P＜0.01)，抗體組

10、(抗TNF-α-IgG組、抗TNF-R1組)SCmRNA表達無明顯變化。進一步證明TNF-α在肝壞死中起重要作用。 10.免疫組化染色分析Caco-2細胞表達SC：無TNF-α刺激時培養(yǎng)Caco-2細胞SC陽性細胞大約為0.5-0.6％，用不同濃度TNF-α刺激后SC陽性細胞明顯增加，400ng/mlTNF-α刺激后SC陽性細胞達到3.0-3.5％。SC主要位于Caco-2細胞漿和細胞膜上。用不同濃度的Sin1刺激后SC陽性細胞

11、明顯下降，不同濃度的Sin1刺激后SC陽性細胞率分別為0μM0.5-0.6％、125μM0.46-0.50％、250μM0.26-0.30％、500μM0.12-0.15％、1000μM0.18-0.22％。 11.Caco-2細胞分泌SC蛋白的半定量分析：SC的分子量為80KD，結(jié)果表明在80KD位置有明顯條帶，加入TNF-α后蛋白表達量明顯增加，與無TNF-α(即濃度為0ng/ml)刺激Caco-2分泌SC蛋白表達量相比明顯

12、升高(P＜0.01)；加入Sin1后蛋白表達量明顯下降，與無Sin1(即濃度為0μM)刺激Caco-2分泌SC蛋白表達量相比明顯降低(P＜0.01)。 12.TNF-α對Caco-2細胞分泌SC的mRNA相對表達量的影響：檢測的mRNA通過管家基因GAPDH進行校正，隨TNF-α濃度升高SC的mRNA相對表達量明顯升高(P＜0.01)。加入Sin1后SC的mRNA相對表達量明顯下降，與無Sin1(即濃度為0μM)刺激Caco-2

13、分泌SC表達的mRNA相對含量相比明顯下降(P＜0.01)。 結(jié)論1.重型肝炎患者血清和糞便中IgA和SIgA較正常對照組明顯升高，但重肝患者腸道SC、IgA在腸上皮細胞漿內(nèi)和膜上分布明顯減弱。 2.重型肝炎患者腸上皮細胞漿和膜上SC、IgA表達降低，引起腸上皮細胞表面的SIgA減少，導致腸道免疫屏障損傷，引起腸道免疫防御功能減弱，可能是重型肝炎患者腹膜炎的一個原因。 3.急性肝壞死小鼠血清、糞便IgA、SIgA

14、顯著升高，但急性肝壞死小鼠IgA在腸上皮細胞漿內(nèi)、膜上和固有層活化淋巴細胞分布明顯減弱，與重型肝炎患者變化一致，因此急性肝壞死動物模型是研究重型肝炎腸道免疫防御的一個很好模型。 4.急性肝壞死小鼠腸上皮細胞表達的SC在分子水平明顯減少，是腸上皮細胞膜上SIgA分布明顯減少的原因，最終引起急性肝壞死小鼠腸道免疫屏障功能明顯減弱。 5.由TNF-α/GalN引起的急性肝壞死動物死亡率和腸道SC、SIgA變化與LPS/GalN