腸道微生態(tài)變化與移植肝CGD的相關(guān)研究.pdf

1、我國是乙型病毒性肝炎高發(fā)地區(qū)，由于缺乏高效抗乙型肝炎病毒藥物，使肝硬化、慢性重型肝炎及肝癌等終末期肝病患者的數(shù)量居高不下。終末期肝病患者的治療最終依賴于肝移植術(shù)。近年來，肝移植手術(shù)在我國取得了長足的發(fā)展。目前，肝移植手術(shù)1年生存率在80％以上，5年生存率大于70％，移植效果接近于國際先進水平，此得益于精湛的手術(shù)及免疫抑制劑的廣泛使用。但肝移植后的各種并發(fā)癥如急、慢性排異、膽道并發(fā)癥、細菌及病毒感染等阻礙了受體存活率及移植肝存活率的進一步

2、提高。 不同于健康人，免疫抑制劑的使用使肝移植患者的免疫處于抑制狀態(tài)，這是肝移植后肝炎病毒及腫瘤復發(fā)的主要原因，也是細菌、病毒感染的主要原因。為數(shù)不多的研究表明，免疫抑制劑中的神經(jīng)貯鈣蛋白(calcineurin)抑制劑包括環(huán)孢素A及FK506均可抑制Lewis大鼠腸道上皮細胞的ATP能量代謝，并導致腸道屏障功能的損傷。Gabe等的臨床研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)K506可抑制腸上皮細胞的能量產(chǎn)生，損害腸道的吸收功能，增加腸道通透性，引起內(nèi)毒素

3、血癥。給肝移植術(shù)后早期患者服用微生態(tài)制劑(合生元)則可顯著降低其術(shù)后早期感染的發(fā)生率，并可縮短抗生素的使用時間。上述這些研究結(jié)果提示在肝移植患者，免疫抑制劑、腸道微生態(tài)及細菌感染三者之間存在著有機的聯(lián)系，但這些動物及臨床研究均沒有檢測腸道細菌生態(tài)的變化情況。 本研究采用分子生物學定性、定量技術(shù)，分析肝移植患者腸道主要菌群的生態(tài)結(jié)構(gòu)變化，同時采用偶氮顯色法、酶標法及放射免疫法檢測內(nèi)毒素、與內(nèi)毒素相關(guān)的腫瘤壞死因子、IL-6及腸道分

4、泌性免疫球蛋白A(SIgA)等免疫指標的變化，研究免疫抑制劑對肝移植患者腸道微生態(tài)的影響及腸道微生態(tài)變化與其全身及腸道局部免疫功能的關(guān)系。 材料與方法1、研究對象1.1健康志愿者共28例，男性25例，女性3例，年齡22-57歲，平均37.6±8.2歲。 1.2肝硬化患者共51例，分別為浙江大學醫(yī)學院附屬第一醫(yī)院的住院或門診病人，其中男性45例，女性6例，年齡28-63歲，平均45.5±9.9歲。本組患者作為肝移植術(shù)后患者

5、的對照組，除1例外，其余50例均未行肝移植。 1.3肝移植術(shù)后患者共111例，其中男性99例，女性12例，年齡22-64歲，平均42.6±9.2。所有的肝移植術(shù)后患者服用免疫抑制劑，主要方案有：CsA+MMF、FK506+MMF、FK506等。 1.4接受肝移植術(shù)中細菌易位研究的肝硬化(部分并發(fā)肝癌)患者78例，男性70例，女性8例；最小年齡26歲，最大年齡62歲，平均年齡47.5±8.9歲。 2、研究標本2.1

6、新鮮糞便、血液、腸系膜淋巴結(jié) 3、研究方法3.1厭氧菌(雙歧桿菌)凍干保存技術(shù)；3.2糞便基因組DNA抽提方法的建立及優(yōu)化；3.3含腸道目標細菌特異16SrDNA基因片斷的質(zhì)粒DNA構(gòu)建、克隆建庫及測序；3.4熒光定量PCR定性、定量分析糞便目的細菌群；3.5放射免疫方法檢測糞便分泌型免疫球蛋白A；3.6鱟試劑偶氮顯色檢測血內(nèi)毒素；3.7ELISA法檢測受試者血液TNFa及IL-6；3.8血液及腸系膜淋巴結(jié)的厭氧培養(yǎng)3.9SPS

7、SforWindows(Version11.5)，SASforWindows(Version8.2)用于臨床資料及檢測數(shù)據(jù)的統(tǒng)計分析 結(jié)果1.建立了雙歧桿菌凍干保存方法，經(jīng)過12個月的4℃保藏，本研究所得的凍干雙歧桿菌菌粉活菌數(shù)在107-108CFU/g菌粉，存活率在88％-99％之間。 2.QIAGEN試劑盒結(jié)合玻璃珠擊打方法的細菌裂解效率最好，獲得DNA純度最高是適合于高質(zhì)量抽提人糞便細菌DNA的方法。 3.

8、78例接受肝移植患者有8例發(fā)生了細菌易位，發(fā)生率為10.3％(8/78)；細菌易位的部位以MLN為主，占62.5％(5/8)，發(fā)生BT的細菌主要是腸道革蘭陰性兼性厭氧桿菌(占55.6％，5/9)，其次為革蘭陽性兼性厭氧球菌(占22.2％，2/9)。 4.細菌易位組患者術(shù)前總膽紅素顯著高于無細菌易位組(P=0.022)；發(fā)生細菌易位的患者其術(shù)后感染的風險是無細菌易位的患者的1.3倍，且存在一定的意義(P=0.05)。 5.

9、與健康人群相比，肝硬化及肝移植患者存在腸道微生態(tài)失衡現(xiàn)象，以肝移植患者較為顯著。肝移植患者主要表現(xiàn)為腸道總細菌量、雙歧桿菌、乳酸桿菌、及糞細菌(F.prausnitzii)數(shù)量顯著減少，而腸道C.bolteae，、ClostridiumclusterⅪ(包括：C.bifermentans，C.difficile，C.glycolicum)組細菌、腸桿菌科細菌及腸球菌顯著增加。 6.肝硬化患者血內(nèi)毒素、IL-6及腸道分泌型免疫球蛋

10、白A顯著增加，而肝移植患者腸道分泌型免疫球蛋白A較健康人及肝硬化患者顯著減少。 7.血內(nèi)毒素的增加與腸道乳酸桿菌及腸道分泌型免疫球蛋白A呈顯著正相關(guān)，血IL-6及TNFa與腸道乳酸桿菌數(shù)量呈顯著正相關(guān)，血IL-6與腸道總細菌量、ClostridiumclusterⅪⅤab組菌量、類桿菌屬-普氏菌屬細菌量及腸球菌量呈顯著負相關(guān)。 8.肝硬化患者腸道乳酸桿菌顯著增加，此可能是一種機體的代償機制。 9.與健康人比較，肝

11、移植及肝硬化患者腸道雙歧桿菌屬細菌總量、腸道假/小鏈狀雙歧桿菌組細菌及青春型雙歧桿菌顯著減少。與健康人比較，肝移植患長雙歧桿菌顯著增多。與肝硬化患者比較，肝移植患者假/小鏈狀雙歧桿菌顯著增多。 10.肝移植患者腸道假/小鏈狀型雙歧桿菌、青春型雙歧桿菌及短型雙歧桿菌檢出率顯著低于健康人群。肝硬化患者腸道雙歧桿菌的種群多樣性分布顯著低于健康人群。 結(jié)論本研究建立了用于腸道微生態(tài)研究的一系列方法，如(1).雙歧桿菌凍干保存技術(shù)

12、；(2).首次比較了4種國際主要微生態(tài)實驗室使用的糞便DNA抽提方法；確立了QIAGEN試劑盒結(jié)合玻璃珠擊打方法是適合高質(zhì)量抽提人糞便細菌DNA的首選方法；(3).建立了用于定性、定量分析腸道菌群生態(tài)分子結(jié)構(gòu)的熒光定量PCR方法。 通過對78例接受肝移植肝硬化患者外周、門靜脈血及腸系膜淋巴結(jié)的細菌培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)其腸道細菌易位發(fā)生率為10.3％(8/78)，腸道細菌是主要檢出菌，術(shù)前總膽紅素水平與腸道細菌易位密切相關(guān)。手術(shù)后感染與腸道

13、細菌易位有一定的相關(guān)性(P=0.05)。 肝硬化與肝移植患者均存在腸道微生態(tài)失衡，以肝移植患者為顯著。首次發(fā)現(xiàn)肝移植患者腸道總細菌量、雙歧桿菌、乳酸桿菌、及糞細菌(F.prausnitzii)數(shù)量顯著減少，而腸道C.bolteae，、ClostridiumclusterⅪ(包括：C.bifermentans，C.difficile，C.glycolicum)組細菌、腸桿菌科細菌及腸球菌顯著增加。肝移植患者使用免疫抑制劑可能是其腸

14、道微生態(tài)失衡的主要原因。肝硬化患者血內(nèi)毒素、IL-6及腸道分泌型免疫球蛋白A顯著增加；首次發(fā)現(xiàn)肝移植患者的腸道分泌型免疫球蛋白A較健康人及肝硬化患者顯著減少。 肝硬化與肝移植患者血內(nèi)毒素的增加與腸道乳酸桿菌及腸道分泌型免疫球蛋白A呈顯著正相關(guān)，血IL-6及TNFa與腸道乳酸桿菌數(shù)量呈顯著正相關(guān)，血IL-6與腸道總細菌量、ClostridiumclusterⅪⅤab組菌量、類桿菌屬-普氏菌屬細菌量及腸球菌量呈顯著負相關(guān)，此提示了腸

15、道菌群的失衡與腸道局部及全身炎癥反應有一定的關(guān)系。 首次提出肝硬化患者腸道乳酸桿菌的顯著增加可能是一種機體的代償機制理論。首次明確肝病患者腸道細菌過度生長(IBO)主要為腸道兼性厭氧細菌，而非腸道專性厭氧菌。 本研究首次對肝硬化及肝移植患者腸道雙歧桿菌屬內(nèi)8種細菌的定性定量進行了研究。分析發(fā)現(xiàn)，假/小鏈狀雙歧桿菌組細菌是人體腸道的優(yōu)勢雙歧桿菌，與健康人群比較，肝硬化及肝移植后患者腸道雙歧桿菌屬細菌總量、假/小鏈狀雙歧桿菌