肝硬化門脈高壓大鼠腸道微生態(tài)狀況的變化及其相關(guān)干預(yù)的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、肝病狀態(tài)下，尤其在肝硬化門脈高壓時(shí)，患者常出現(xiàn)如惡心、嘔吐、胃納明顯下降等癥狀，相對(duì)而言，腸道菌群營(yíng)養(yǎng)底物缺乏；肝功能受損其合成能力下降，血漿中的白蛋白水平急聚降低，因而易產(chǎn)生腹水；膽汁分泌不足，腸道內(nèi)膽鹽缺乏；肝臟結(jié)構(gòu)改變，肝硬化門脈高壓形成，胃、腸血管動(dòng)靜脈短路開放，血管被動(dòng)瘀血和主動(dòng)充血，血管血容量增加，血流瘀滯、組織缺氧，出現(xiàn)門脈高壓性胃病及腸??；臨床上為防止消化道出血、感染，預(yù)防性或治療性應(yīng)用抑酸藥物如洛賽克和抗生素等。以上因

2、素的存在均可導(dǎo)致腸道微生態(tài)失調(diào)。表現(xiàn)為專性厭氧菌雙歧桿菌、乳酸桿菌顯著減少，而革蘭陰性桿菌（GNR）顯著增多，存在腸道GNR過度性生長(zhǎng)、腸管擴(kuò)張、腸壁變薄等情況。這種失調(diào)出現(xiàn)于整個(gè)腸道，且腸道微生態(tài)失衡程度與肝硬化門脈高壓的嚴(yán)重程度相關(guān)，并隨肝功能出現(xiàn)好轉(zhuǎn)而逐漸恢復(fù)。腸道微生態(tài)失調(diào)，腸道定植抗力下降及腸道屏障功能受損是其腸道內(nèi)毒素移位、內(nèi)毒素血癥形成的原因之一。業(yè)已證明，嚴(yán)重肝病時(shí)都存在內(nèi)毒素血癥，其發(fā)生率約為58%一100%。內(nèi)毒素及

3、由內(nèi)毒素刺激機(jī)體產(chǎn)生的TNF-a、IL-1等細(xì)胞因子可引起肝細(xì)胞凋亡、壞死，加重肝臟原有的損傷。腸道菌群恢復(fù)時(shí)可以降低門靜脈內(nèi)毒素，但是大鼠腸道內(nèi)毒素的下降要晚于腸道菌群的恢復(fù)。隨著肝硬化門脈高壓病情的惡化，可出現(xiàn)各種并發(fā)癥，其中與腸道微生態(tài)有密切關(guān)系的有繼發(fā)性細(xì)菌感染、內(nèi)毒素血癥、上消化道出血等。因此，在治療肝硬化門脈高壓癥時(shí)，尚需從腸道微生態(tài)的角度加以對(duì)其并發(fā)癥的防治。消化道出血?dú)v來是外科研究和治療的重點(diǎn)。門脈高壓性胃病、門脈高壓性

4、腸病等所致的消化道出血、貧血、消化吸收不良、菌群失調(diào)和感染等病癥相對(duì)缺乏防、治經(jīng)驗(yàn)。本研究：
　　 目的：
　　 1、構(gòu)建穩(wěn)定、可靠的肝硬化門脈高壓大鼠動(dòng)物模型，研究該模型肝臟及腸道病變情況。
　　 2、研究肝硬化門脈高壓大鼠菌群移位、腸道微生態(tài)、腸黏膜屏障功能及內(nèi)毒素血癥等改變，并探討TNF-α、對(duì)Occludin蛋白以及腸黏膜屏障功能的影響，在腸源性內(nèi)毒素血癥發(fā)病機(jī)制中的作用。
　　 3、研究微

5、生態(tài)制劑-乳果糖在調(diào)節(jié)門脈高壓大鼠腸道菌群失調(diào)、抑制菌群移位、改善內(nèi)毒素血癥進(jìn)而改善肝功能的作用，探討其在肝硬化門脈高壓治療中的作用機(jī)制。
　　 4、研究微生態(tài)制劑-乳果糖對(duì)行脾切除+選擇性斷流術(shù)后門脈高壓大鼠腸道微生態(tài)狀況的影響，探討其在門脈高壓癥外科治療中的意義。
　　 方法：
　　 1、肝硬化門脈高壓大鼠動(dòng)物模型建立：按0.4 ml/100g劑量予以背部皮下注射50% CCL4橄欖油溶液，每周2次，持續(xù)

6、4周，第5周開始改以0.5ml/100g標(biāo)準(zhǔn)背部皮下注射，每周2次，持續(xù)4周，模型制作共10周。行上腹部CT、MR掃描，觀察肝硬化、脾腫大、腹水等情況；以HE染色、Masson三色染色、透射電鏡觀察大鼠肝臟及腸組織病變情況；測(cè)量門靜脈直徑和門靜脈壓力以了解該模型血液動(dòng)力學(xué)變化情況。
　　 2、電鏡觀察腸上皮細(xì)胞緊密連接超微結(jié)構(gòu)和絨毛病變；檢測(cè)細(xì)菌易位率；分析腸道菌群構(gòu)成情況并作菌種DNA指紋圖譜分析；做肝功能測(cè)定；采用改良的偶

7、氮基質(zhì)顯色法行內(nèi)毒素測(cè)定；采用免疫組織化學(xué)方法和Western blot法分別測(cè)定其末段回腸和結(jié)腸的腫瘤壞死因子（tumor necrosis factorα，TNF-α）及緊密連接蛋白（Occludin）表達(dá)水平。
　　 3、對(duì)門脈高壓模型大鼠進(jìn)行乳果糖干預(yù)治療即：每日灌服乳果糖(67%)5ml/kg，每日2次，直至大鼠排稀便，研究其腸黏膜通透性及腸微生態(tài)改變，檢測(cè)細(xì)菌移位、肝功能、內(nèi)毒素血癥情況。
　　 4、將門

8、脈高壓大鼠行“脾切除加選擇性賁門周圍血管離斷術(shù)”后，應(yīng)用乳果糖干預(yù)治療，研究其腸黏膜通透性及腸微生態(tài)改變，檢測(cè)細(xì)菌移位、肝功能、內(nèi)毒素血癥情況。
　　 結(jié)果：
　　 1、復(fù)合法四氯化碳大鼠門脈高壓模型，死亡率28％；四氯化碳用藥10周后見大鼠體形消瘦，CT檢查示肝臟體積縮小，脾臟略有增大，伴有肝周少量腹水；病理切片見肝內(nèi)假小葉廣泛形成，假小葉內(nèi)可見纖維再分割現(xiàn)象，同時(shí)伴有明顯的肝細(xì)胞再生結(jié)節(jié)；開腹穿刺測(cè)壓結(jié)果：對(duì)照組（

9、7.62±2.02）mmHg、實(shí)驗(yàn)組（15.76±2.68）mmHg，兩組比較具有顯著性差異（P<0.05）。表明存在肝硬化門靜脈高壓表現(xiàn)。
　　 2、門脈高壓組細(xì)菌易位發(fā)生率較正常對(duì)照組明顯增高（P<0.05），乳桿菌、雙歧桿菌的數(shù)量則顯著減少（P<0.01），而腸桿菌、腸球菌數(shù)量則明顯增多（P<0.01）；門脈高壓組肝功能各項(xiàng)（AST、ALT、TBLL、ALB）叫正常組均明顯惡化（P<0.01），其血清內(nèi)毒素水平（0.44

10、±0.07Eu/ml）亦明顯高于正常組之（0.20±0.08Eu/ml）（P<0.01）；回、結(jié)腸的緊密連接蛋白Occludin及TNF-α表達(dá)，兩組比較具有顯著性差異（P<0.01）。
　　 3、應(yīng)用乳果糖干預(yù)后，門脈高壓治療對(duì)照組（A組）細(xì)菌易位發(fā)生率較乳果糖組（B組）和正常對(duì)照（C組）均明顯增高（P<0.05）；B組及C組乳桿菌、雙歧桿菌的數(shù)量均較A組增多（P<0.01），而腸桿菌、腸球菌數(shù)量則顯著降低（P<0.01）；

11、A組細(xì)菌DNA指紋圖譜條帶明顯減少，且出現(xiàn)異常條帶，B組腸道內(nèi)優(yōu)勢(shì)菌群的基因條帶與C組具有高度一致性；與B、C組比較，A組肝功能各項(xiàng)（AST、ALT、TBLL、ALB）均明顯惡化（P<0.01）；A組血清內(nèi)毒素水平（0.44±0.07Eu/ml）亦明顯高于B、C組之（0.33±0.06Eu/ml）、（0.20±0.08Eu/ml）（P<0.01）；回、結(jié)腸的緊密連接蛋白及TNF-α表達(dá)，A組與B、C組比較，具有顯著性差異（P<0.01）

12、。
　　 4、行“脾切除加選擇性賁門周圍血管離斷術(shù)”后門脈高壓大鼠，應(yīng)用乳果糖干預(yù)治療。術(shù)后治療對(duì)照組（PC組）細(xì)菌易位發(fā)生率較術(shù)后乳果糖組（PB組）和假手術(shù)組（PD組）均明顯增高（P<0.05）；PB組及PD組乳桿菌、雙歧桿菌的數(shù)量均較PC組增多（P<0.01），而腸桿菌、腸球菌數(shù)量則顯著降低（P<0.01）；PC組細(xì)菌DNA指紋圖譜條帶明顯減少，B組腸道內(nèi)優(yōu)勢(shì)菌群的基因條帶與術(shù)前治療組（A組）、PD組無明顯差異；與PB、P

13、D組比較，PC組肝功能各項(xiàng)（AST、ALT、TBLL）均明顯升高（P<0.01），而血清白蛋白（ALB）則顯著降低（P<0.01）；PC組血清內(nèi)毒素水平（0.51±0.08Eu/ml）亦明顯高于PB、PD組之（0.31±0.09Eu/ml）、（0.34±0.09Eu/ml）（P<0.01）；回、結(jié)腸的緊密連接蛋白及TNF-α表達(dá)，PC組與PB、PD組比較，具有顯著性差異（P<0.01）。
　　 結(jié)論：
　　 我們應(yīng)用四氯

14、化碳橄欖油復(fù)合法所構(gòu)建的動(dòng)物模型其組織學(xué)改變與人類肝硬變相似，門靜脈壓力顯著增高并產(chǎn)生一定程度的門體交通支分流，是研究門脈高壓癥的理想模型。
　　 門脈高壓大鼠隨著病變的進(jìn)展，存在著明顯的腸黏膜屏障功能障礙，通透性升高，出現(xiàn)腸道微生態(tài)紊亂，菌群失調(diào)，菌群移位和腸源性內(nèi)毒素血癥，同時(shí)肝功能損害加劇。
　　 微生態(tài)制劑乳果糖可以明顯改善門脈高壓大鼠腸道的微生態(tài)，可促進(jìn)有益菌的生長(zhǎng)從而提高定植抗力，并籍此抑制潛在致病菌生長(zhǎng)及其