B(a)P代謝產物BPDE的檢測技術及其對DNA損傷的研究.pdf

1、苯并(a)芘[benzo(a)pyrene，B(a)P]，又名3，4-苯并芘，由一個苯環(huán)和一個芘分子結合而成,是一種廣泛存在于人們生產、生活環(huán)境中的污染物。1933年，英國學者從煤焦油中分離出苯并芘（B(a)P），并成功誘發(fā)出小鼠皮膚癌，使B(a)P成為第一個被發(fā)現的環(huán)境化學致癌物。動物實驗證明，B(a)P對局部或全身都有致癌作用；流行病學研究表明，B(a)P可以通過皮膚、呼吸道、消化道等多種途徑被人體吸收，能夠誘發(fā)皮膚癌，肺癌，直腸癌

2、，胃癌，膀胱癌等。除致癌外，B(a)P還具有致畸，致突變作用，對人體內分泌系統(tǒng)也有一定的干擾作用。1983年國際癌癥機構將其確認為環(huán)境致癌物。 B(a)P雖然被認為是高活性致癌劑，但并非直接致癌物，必須經細胞微粒體中的混合功能氧化酶激活才具有致癌性。B(a)P在體內首先經混合功能氧化酶細胞色素P450酶(CYP1A1)催化在結構彎區(qū)形成7,8環(huán)氧苯并芘,然后在環(huán)氧化物酶和CYP1B1作用下形成7,8二氫二醇苯并芘,該物質經混合功

3、能氧化酶催化,形成二氫二醇環(huán)氧苯并(a)芘(BPDE)。BPDE能夠與與體內生物大分子如DNA，蛋白質等結合生成共價化合物，被認為是B(a)P在體內的終致癌物。因此隨著B(a)P越來越深入的研究，BPDE的致癌性也受到廣泛關注，但是具體作用機制尚不明確。 BPDE主要與DNA的小溝上的親核位點鳥嘌呤的環(huán)外胺基端共價結合,產生特異突變,形成BPDE-N2-dG。BPDE加合物能夠阻止DNA復制，造成復制阻斷，復制準確性降低，誘發(fā)加

4、合物對應位點上的堿基誤滲，最終出現G-T的轉變及部分G-A的錯誤突變，這既是癌變的啟動因子，又在癌變發(fā)展過程起著關鍵的作用。 B(a)P主要存在于煤焦油、各類碳，石油等燃燒時產生的煙氣、汽車尾氣中，還有工業(yè)廢水中及吸煙時香煙產生的煙霧中。另外燒烤和熏制食品也含有大量的B(a)P。因此除了職業(yè)暴露外，在生活中也會經常接觸到B(a)P。鑒于B(a)P對人類的危害性，這幾十年來已經有大量的研究報道了B(a)P的終致癌物質BPDE的檢測

5、方法，但其絕大部分的研究都是著重于檢測BPDE的DNA﹑蛋白加合物或BPDE加合物的水解產物進行定性，定量分析，這些方法前處理步驟繁多致使BPDE加合物的回收率低。因此如果能夠選擇直接BPDE，不僅簡單易行，可以提供個體“內接觸”量或“有效接觸”量，還能提供化學毒物的代謝活化信息。 在本研究中，采用高效液相色譜-紫外檢測和熒光檢測法對BPDE標準品溶液及細胞液中的BPDE進行檢測，為進一步研究BPDE的定性和定量分析奠定基礎；用

6、單細胞凝膠電泳方法檢測了BPDE對體外培養(yǎng)的HepG2細胞的DNA損傷，以期反映BPDE對遺傳物質的損傷；最后是對B(a)P的原型消減進行探索性研究，用B(a)P單獨染毒或B(a)P與PCB153聯(lián)合染毒HepG2細胞，然后用HPLC-UVD﹑FD檢測經HepG2細胞代謝后細胞中的B(a)P的濃度，探索PCB153在B(a)P代謝過程中的作用。 第一部分、B(a)P代謝產物BPDE的檢測技術。 1. B(a)P代謝產物B

7、PDE的HPLC－紫外檢測技術。 采用高效液相色譜－紫外測定的方法檢測BPDE標準品溶液及在細胞液中的BPDE。結果發(fā)現：BPDE標準品在DMSO溶液中的濃度與其峰面積呈現出良好的線性關系，其線性回歸方程為Y=637138X-124587，R2=0.9982。BPDE標準品在濃度1.00～20.00μg/ml范圍內具有良好的線性關系，該方法的最低檢出限為0.0625μg/ml。BPDE標準品在細胞裂解液中的線性回歸方程為Y=42

8、4298X＋24598，R2=0.9921。本方法的日內精密度RSD 2.9～3.6％和日間精密度RSD 4.3～5.9％。BPDE化學性質極不穩(wěn)定，對光，濕度及酸很敏感。在同樣的濃度下，BPDE標準品和細胞裂解液中的BPDE標準品的峰面積出現差異，經過分析，在細胞裂解液中的BPDE的含量偏低，但顯著高于在環(huán)境中的自然變化。 2. B(a)P代謝產物BPDE的HPLC－熒光檢測技術。 采用高效液相色譜－熒光測定方法檢測B

9、PDE標準品溶液及在細胞液中的BPDE。結果發(fā)現：BPDE標準品在DMSO溶液中的濃度與其峰面積呈現出良好的線性關系，其線性回歸方程為Y=2E+07X+178569，R2=0.9988。BPDE標準品在濃度0.01～1.00μg/ml范圍時具有良好的線性關系，該方法的最低檢出限為0.005μg/ml。本方法的日內精密度RSD 3.2～4.6％和日間精密度RSD 5.9～7.4％。在同樣的濃度下，BPDE標準品和細胞裂解液中的BPDE標準

10、品的峰面積出現差異，經過分析，在細胞裂解液中的BPDE的含量偏低，但顯著高于在環(huán)境中的自然變化。 第二部分、BPDE致HepG2細胞DNA損傷的毒理學研究。 用0.05μmol/L，0.1μmol/L，0.5μmol/L，1μmol/L，2μmol/L5個不同濃度的BPDE染毒體外培養(yǎng)的HepG2細胞，用50μmol/LB(a)P做陽性對照，采用單細胞凝膠電泳的方法檢測BPDE對HepG2細胞的DNA損傷。結果顯示，在本

11、實驗中不同濃度的BPDE染毒組與正常組相比Olive尾矩均有顯著性差異(P＜0.01),而不同濃度組之間差異也有顯著性(P＜0.01),BPDE最高濃度組與B(a)P陽性對照組相比也有顯著性差異(P＜0.01)，隨著BPDE濃度的增加，HepG2細胞的Olive尾矩值逐漸增大，并呈明顯的劑量-依賴關系。這說明反式BPDE可引起DNA斷裂損傷,且損傷程度與染毒劑量有關。 第三部分、苯并(a)芘原型代謝消減的探索性研究。 用

12、50μmol/L B(a)P對HepG2細胞單獨作用72個小時或先用不同濃度(0.1μmol/L，1μmol/L，10μmol/L，100μmol/L)PCB153對HepG2細胞預處理48個小時然后再與50μmol/L B(a)P聯(lián)合作用24個小時，采用HPLC-UVD﹑FD檢測HepG2細胞內經過代謝后的B(a)P的濃度。結果顯示，PCB153在低濃度0.1μmol/L和1μmol/L與B(a)P聯(lián)合作用時，在HepG2細胞內檢測到

13、的B(a)P濃度要高于B(a)P單獨作用的濃度，且隨著PCB153濃度的增高，在HepG2細胞內檢測到的B(a)P濃度有增高的趨勢。但是在PCB153的濃度為10μmol/L和100μmol/L時，它與B(a)P的聯(lián)合作用后在HepG2細胞內檢測到的B(a)P濃度要低于B(a)P單獨作用的濃度，且隨著PCB153濃度的增高，在HepG2細胞內檢測到的B(a)P濃度呈現出降低的趨勢。由此推測PCB153在誘導P450酶活性時可能存在一定的