實(shí)驗(yàn)性淋巴瘀滯誘發(fā)家兔肝組織結(jié)構(gòu)病理變化及其與脂肪肝的關(guān)系.pdf

1、肝臟淋巴系統(tǒng)(lymphatic system)不僅是組織回流系統(tǒng)，而且是免疫控制系統(tǒng)。肝臟淋巴管道作為肝組織的回流系統(tǒng)，是對(duì)血液回流系統(tǒng)重要的補(bǔ)充，在維持肝臟正常功能中起重要作用。目前對(duì)于肝臟靜脈、膽管研究的較多，而對(duì)于肝臟淋巴管道系統(tǒng)研究較少，尤其是作為肝組織的回流系統(tǒng)，在肝臟脂代謝及脂蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)方面的作用，缺乏研究。
　　本實(shí)驗(yàn)分為三部分，通過腹部手術(shù)結(jié)扎新西蘭大白兔腹段胸導(dǎo)管，造成實(shí)驗(yàn)性肝淋巴瘀滯的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型;應(yīng)用光鏡和掃

2、面、透射電鏡，觀察正常和實(shí)驗(yàn)動(dòng)物肝組織的病理形態(tài)學(xué)變化;利用酶聯(lián)免疫吸附法、共聚焦技術(shù)，檢測(cè)肝臟載脂蛋白E和肝X因子受體的變化;探討肝淋巴瘀滯對(duì)肝臟組織結(jié)構(gòu)和脂代謝的影響，實(shí)驗(yàn)內(nèi)容和結(jié)果如下:
　　第一部分胸導(dǎo)管結(jié)扎誘發(fā)家兔肝淋巴瘀滯的形態(tài)學(xué)觀察
　　目的:在腹部手術(shù)結(jié)扎家兔胸導(dǎo)管，造成肝淋巴回流阻滯，觀察實(shí)驗(yàn)動(dòng)物腹腔及肝臟脂肪堆積情況，觀察此種方式制造家兔肝淋巴瘀滯動(dòng)物模型的結(jié)果。
　　方法:(1)選用健康清潔級(jí)12

3、周齡新西蘭大白兔24只，體重1500-1800g，雄性，采用對(duì)照研究的方法，隨機(jī)分為兩組，實(shí)驗(yàn)（胸導(dǎo)管結(jié)扎）組14只和對(duì)照（假性手術(shù)）組10只;(2)實(shí)驗(yàn)開始前1.5小時(shí)，用食用大豆油10毫升經(jīng)灌胃針灌喂家兔，實(shí)驗(yàn)開始時(shí)，首先用10％水合氯醛(2.4 ml/kg)經(jīng)新西蘭大白兔耳緣靜脈注射，深度麻醉，無菌操作，將乳糜池和腹段胸導(dǎo)管清楚的顯露，采用自左側(cè)腎上腺上方向上游離出新西蘭大白兔腹主動(dòng)脈1厘米，玻璃分離器將此段腹主動(dòng)脈挑起，4號(hào)縫線

4、將腹段胸導(dǎo)管連同其周圍的組織一起結(jié)扎。關(guān)閉腹腔前，腹腔注射慶大霉素5.0 mg/kg，生理鹽水20毫升。對(duì)照組只是充分游離胸導(dǎo)管而不結(jié)扎。(3)手術(shù)環(huán)境:操作室為清潔級(jí)，手術(shù)臺(tái)清潔，手術(shù)操作過程嚴(yán)格遵循無菌操作原則和無菌操作管理制度。(4)術(shù)后的新西蘭大白兔在潔凈的，室溫18-24℃，相對(duì)濕度60％的環(huán)境中分籠飼養(yǎng)，12小時(shí)白天、12小時(shí)黑夜的生活周期，自由飲水，攝食200g/d（由河北醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供的嚙齒類普通食物）。(5)

5、術(shù)后6個(gè)月，所有的實(shí)驗(yàn)和對(duì)照動(dòng)物，在10％水合氯醛（2.4ml/kg）經(jīng)新西蘭大白兔耳緣靜脈注射，深度麻醉下，同造模時(shí)無菌操作過程，開腹觀察新西蘭大白兔腹腔和肝臟脂肪堆積情況。
　　結(jié)果:
　　1.造模前:肝臟呈鮮紅色，質(zhì)地柔軟，邊緣銳利，表面光滑，腹腔脂肪較少，腸系膜清亮透明。造模后:(1)實(shí)驗(yàn)組:肝臟呈暗紅色，質(zhì)地粗糙，肝臟邊緣變圓頓，表面有油膩感，有輕度肝纖維化的感覺，肝臟表面裂隙變寬、變深，伴有肝被膜下脂肪沉積;腹腔

6、脂肪沉積明顯增多，腸系膜上可見明顯脂肪沉積，并且在腸系膜上可見成串的脂肪球或脂肪泡。(2)對(duì)照組:肝臟色澤依舊鮮紅，質(zhì)地依舊柔軟，邊緣依舊銳利，表而依舊光滑、細(xì)膩;腹腔未見脂肪沉積，腸系膜依舊清亮、透明。
　　2.HE染色石蠟切片光鏡下觀察:(1)對(duì)照組新西蘭大白兔:肝小葉結(jié)構(gòu)完整:門管區(qū)的門靜脈、肝動(dòng)脈及膽管結(jié)構(gòu)完整、清晰，小葉中央靜脈完整、清晰;位于小葉中央靜脈與匯管區(qū)之間的肝細(xì)胞排列成索狀，肝細(xì)胞排列規(guī)律，無雜亂，肝血竇未見

7、異常，肝細(xì)胞形態(tài)規(guī)則，細(xì)胞內(nèi)無脂肪滴，無肝細(xì)胞疏松變性，未見到肝細(xì)胞壞死，肝被膜的扁平上皮細(xì)胞排列整齊，被膜下無細(xì)胞浸潤。(2)實(shí)驗(yàn)組新西蘭大白兔:肝小葉結(jié)構(gòu)依舊完整:門管區(qū)的門靜脈、肝動(dòng)脈及膽管結(jié)構(gòu)完整、清晰，但周圍有淋巴細(xì)胞浸潤，匯管區(qū)可見擴(kuò)張的淋巴管，小葉中央靜脈依舊完整、清晰;位于小葉中央靜脈與匯管區(qū)之間的肝細(xì)胞排列成索狀，肝細(xì)胞排列較規(guī)律，無雜亂，肝血竇略顯擴(kuò)張，肝細(xì)胞體積增大，肝細(xì)胞內(nèi)可見脂肪滴，可見肝細(xì)胞疏松變性，偶見到肝

8、細(xì)胞壞死，肝小葉內(nèi)含有脂肪的肝細(xì)胞數(shù)目明顯增多，而且越接近匯管區(qū)肝細(xì)胞脂肪變性越輕，小葉中央靜脈周圍也可見肝細(xì)胞脂肪變性，出現(xiàn)少量肝細(xì)胞核固縮的現(xiàn)象，肝細(xì)胞周圍可見以淋巴細(xì)胞為主的炎細(xì)胞浸潤。越是接近肝小葉中央靜脈，肝細(xì)胞脂肪變性的程度越嚴(yán)重。未見肝小葉結(jié)構(gòu)破壞及異常，未見假小葉。可見肝門管區(qū)輕度纖維化。覆蓋于肝組織的腹膜上皮扁平，扁平的上皮細(xì)胞排列不整齊，上皮下可見淋巴管擴(kuò)張。
　　3.造模前和造模6個(gè)月后體重的變化:實(shí)驗(yàn)組術(shù)后

9、6個(gè)月健康成活8只，體重3000-3500g，平均體重3381.25g，實(shí)驗(yàn)前后體重平均增加1718.75±114.06g;對(duì)照組術(shù)后6個(gè)月健康成活8只，體重2500-3000g，平均體重2731.25g，實(shí)驗(yàn)前后體重平均增加1093.75±129.69g。造模前和造模6個(gè)月后體重的變化:實(shí)驗(yàn)組結(jié)扎胸導(dǎo)管后體重明顯升高，與對(duì)照組相比差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。（P＜0.05）
　　結(jié)論:采用手術(shù)結(jié)扎新西蘭大白兔胸導(dǎo)管腹段的方法，可以建立新

10、西蘭大白兔肝臟淋巴瘀滯實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型;結(jié)扎新西蘭大白兔胸導(dǎo)管腹段造成肝臟淋巴瘀滯，肝細(xì)胞內(nèi)脂肪沉積，肝細(xì)胞脂肪變性，肝臟脂肪變性，甚至輕度纖維化。
　　第二部分實(shí)驗(yàn)性肝淋巴瘀滯誘發(fā)肝組織細(xì)微和超微結(jié)構(gòu)變化
　　目的:探討實(shí)驗(yàn)性肝淋巴瘀滯對(duì)新西蘭大白兔肝細(xì)胞和肝被膜扁平細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的影響。
　　方法:實(shí)驗(yàn)用新西蘭大白兔選擇、飼養(yǎng)、造模等方法同上。術(shù)后6個(gè)月，所有的實(shí)驗(yàn)和對(duì)照動(dòng)物，在10％水合氯醛(2.4ml/kg)經(jīng)新西蘭

11、大白兔耳緣靜脈注射，深度麻醉下，同造模時(shí)無菌操作過程，開腹:切取臨近鐮狀韌帶的小塊肝臟組織，用生理鹽水、2.5％戊二醛0.1 M磷酸鹽緩沖液(pH7.4)依次洗滌，放入2.5％戊二醛0.1M磷酸鹽緩沖液(pH7.4)保存，備掃描電鏡用;切取臨近肝表面的小塊肝臟組織，用生理鹽水、4％戊二醛0.1M磷酸鹽緩沖液(pH7.4)依次洗滌，放入4％戊二醛0.1M磷酸鹽緩沖液(pH7.4)保存，備透射電鏡用。
　　結(jié)果:
　　1.HE染

12、色石蠟切片光鏡下觀察:同前。
　　2.肝組織表面掃描電子顯微鏡觀察:(1)對(duì)照組新西蘭大白兔:肝被膜表面扁平的上皮細(xì)胞排列整齊，細(xì)胞形態(tài)規(guī)整，扁平上皮細(xì)胞表面光滑，其微絨毛主要分布于扁平上皮細(xì)胞的邊緣，扁平上皮細(xì)胞之間的間隙清晰可見，其間微絨毛稀疏，統(tǒng)計(jì)三張5000倍掃面電鏡下，每張20個(gè)較為清晰的扁平上皮細(xì)胞之間的間隙，計(jì)算扁平上皮細(xì)胞之間的間隙大小為1.17um;肝被膜表面的腹膜孔清晰可見，腹膜孔存在于三個(gè)相鄰上皮細(xì)胞之間，其

13、表面可見少量吞噬細(xì)胞，統(tǒng)計(jì)三張5000倍掃面電鏡下，每張20個(gè)較為清晰的扁平上皮細(xì)胞之間的腹膜孔，計(jì)算扁平上皮細(xì)胞之間的腹膜孔大小為2.79um。(2)實(shí)驗(yàn)組新西蘭大白兔:肝被膜表面扁平上皮細(xì)胞排列較規(guī)整，細(xì)胞略呈扁橢圓形，主要存在于扁平上皮細(xì)胞邊緣的微絨毛增多、變長，原本光滑的扁平上皮細(xì)胞表面也覆蓋了大量的微絨毛;整個(gè)扁平上皮細(xì)胞的微絨毛數(shù)量呈現(xiàn)增多，不但密布于扁平上皮細(xì)胞之間的間隙，還分布于扁平上皮細(xì)胞的表面，致使扁平上皮細(xì)胞之間的

14、間隙變得不甚清晰;扁平上皮細(xì)胞之間的間隙變寬，同樣的方法計(jì)算間隙大小為2.08um，與對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);肝被膜表面的腹膜孔清晰可見，存在于三個(gè)相鄰上皮細(xì)胞之間，同樣的方法計(jì)算腹膜孔大小為3.98um，與對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），其表面的吞噬細(xì)胞數(shù)量多，腹膜孔周圍可見直徑約5-7 um的球形小泡，表面有棘狀突起及微絨毛，另外，肝被膜表面可見大量直徑約1 um的小泡。
　　3.肝組織超薄切片

15、透射電子顯微鏡觀察:(1)對(duì)照組新西蘭大白兔:肝細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)完整、清晰，胞漿豐富，胞漿內(nèi)富含各種細(xì)胞器，肝細(xì)胞核居中或略偏，細(xì)胞核呈圓形，細(xì)胞核大，細(xì)胞核內(nèi)常染色質(zhì)均勻分布，異染色質(zhì)很少，核仁清晰，核膜完整、清晰，核膜孔清晰，核膜外的高爾基復(fù)合體結(jié)構(gòu)完整、清晰，胞漿可見豐富的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和線粒體，線粒體呈桿狀、球形，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)呈管、泡狀分布于胞漿各處，細(xì)胞漿內(nèi)含有大量的深色的梅花樣的糖原顆粒，細(xì)胞漿未見脂滴。細(xì)胞漿內(nèi)有少量的、深色的、體積大小不一

16、的球形溶酶體，散在分布于胞漿各處。肝血竇結(jié)構(gòu)正常，血竇旁可見Kuffer細(xì)胞，肝血竇內(nèi)皮細(xì)胞間的內(nèi)皮間孔未見異常增寬，Kuffer細(xì)胞呈不規(guī)則形狀，細(xì)胞核位于一側(cè)，細(xì)胞核呈不規(guī)則形，核內(nèi)染色質(zhì)小均勻，較多異染色質(zhì)，Kuffer細(xì)胞胞漿內(nèi)含有大量的、深色的、大小不一、球形的溶酶體。位于肝血竇周圍的間質(zhì)間隙未見增寬，可見少量膠原纖維，肝細(xì)胞的竇周間隙面可見較多微絨毛。肝細(xì)胞間可見毛細(xì)膽管，毛細(xì)膽管內(nèi)無瘀膽。兩個(gè)肝細(xì)胞間的間隙未見異常。(2)

17、實(shí)驗(yàn)組新西蘭大白兔:與對(duì)照組相比，肝細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)有異常改變，最明顯的是肝細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)了較多的脂肪滴，脂肪滴呈大小較均勻的、白色的球形,位于胞漿內(nèi)，肝細(xì)胞核也出現(xiàn)異常改變，肝細(xì)胞核核膜間隙增寬，細(xì)胞核內(nèi)出現(xiàn)大量深色的異染色質(zhì)團(tuán)塊，深色的異染色質(zhì)團(tuán)塊位于核膜下，出現(xiàn)的染色質(zhì)邊集;胞質(zhì)內(nèi)未見深色的梅花樣的糖原顆粒;可見雙核肝細(xì)胞。肝細(xì)胞旁的間隙及竇周間隙增寬，竇周間隙內(nèi)可見儲(chǔ)脂細(xì)胞，細(xì)胞核呈不規(guī)則形狀，核內(nèi)染色質(zhì)不均勻，較多異染色質(zhì)，成堆的脂

18、肪滴位于細(xì)胞核旁，細(xì)胞核被推移到細(xì)胞的一側(cè)，胞漿內(nèi)可見含有電子密度致密的核心的分泌顆粒。肝血竇內(nèi)皮細(xì)胞間孔變寬。肝細(xì)胞間間隙增寬。竇周間隙及肝細(xì)胞周圍間質(zhì)間隙內(nèi)膠原纖維明顯增多。肝細(xì)胞間毛細(xì)膽管內(nèi)瘀膽。
　　結(jié)論:肝臟淋巴瘀滯，導(dǎo)致肝細(xì)胞內(nèi)脂肪沉積，肝細(xì)胞脂肪變性，匯管區(qū)纖維化;肝小葉淋巴細(xì)胞浸潤;肝臟淋巴瘀滯，導(dǎo)致肝被膜扁平上皮細(xì)胞的微絨毛增多、變長，扁平上皮細(xì)胞之間的間隙變寬，存在于三個(gè)相鄰上皮細(xì)胞之間的腹膜孔也變寬，肝被膜表

19、面可見大量直徑約1 um的小泡，并出現(xiàn)淋巴樣細(xì)胞。
　　第三部分肝淋巴瘀滯誘發(fā)肝組織載脂蛋白E和肝X因子受體的變化
　　目的:探討實(shí)驗(yàn)性淋巴瘀滯對(duì)肝脂代謝的影響以及可能的機(jī)制。
　　方法:實(shí)驗(yàn)用新西蘭大白兔選擇、飼養(yǎng)、造模等方法同上。術(shù)后6個(gè)月，所有的實(shí)驗(yàn)和對(duì)照動(dòng)物，在10％水合氯醛(2.4ml/kg)經(jīng)新西蘭大白兔耳緣靜脈注射，深度麻醉下，同造模時(shí)無菌操作過程，開腹:切取1.0×1.0×1.0cm大小的肝臟組織，用生

20、理鹽水、4％多聚甲醛依次洗滌，放入4％多聚甲醛，備HE染色、免疫組化檢查用。肝后下腔靜脈取血5ml，經(jīng)3000 r/min離心10 min分離血清，取上清再經(jīng)濾紙濾過后，-70℃保存。
　　結(jié)果:
　　1.血清血脂四項(xiàng)結(jié)果:通過對(duì)實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組2組新西蘭大白兔血清膽固醇、游離脂肪酸、甘油三酯和極低密度脂蛋白的水平進(jìn)行檢測(cè)和分析，發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)組新西蘭大白兔血清中游離脂肪酸、甘油三酯以及極低密度脂蛋白水平升高，較對(duì)照組有明顯，差異具

21、有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);但是，兩組新西蘭大白兔的血清膽固醇水平差異不明顯，兩組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。
　　2.HE染色石蠟切片光鏡下觀察:同前。
　　3.免疫熒光化學(xué)染色、激光共聚焦顯微鏡觀察:(1)對(duì)照組新西蘭大白兔:肝組織免疫熒光強(qiáng)度清晰，集中趨勢(shì)明顯，代表載脂蛋白E的綠色熒光主要集中在匯管區(qū)，與代表肝X受體的紅色熒光集中區(qū)域一致，雙通道結(jié)果顯示，兩者染色重合的黃色區(qū)域并不多，主要集中于匯管區(qū)。選取典

22、型區(qū)域3個(gè)，圍繞匯管區(qū)劃線，統(tǒng)計(jì)免疫熒光強(qiáng)度，對(duì)照組代表載脂蛋白E的綠色熒光強(qiáng)度為67.31±12.23 AU，代表肝X受體的紅色熒光強(qiáng)度為191.17±35.69AU。(2)實(shí)驗(yàn)組新西蘭大白兔:肝組織免疫熒光強(qiáng)度弱，明顯低于對(duì)照組，集中趨勢(shì)與對(duì)照組一致。免疫熒光強(qiáng)度分析，不論代表載脂蛋白E的綠色熒光，還是代表肝X受體的紅色熒光，強(qiáng)度均較對(duì)照組減弱。選取典型區(qū)域3個(gè)，圍繞匯管區(qū)劃線，統(tǒng)計(jì)免疫熒光強(qiáng)度，實(shí)驗(yàn)組代表載脂蛋白E的綠色熒光強(qiáng)度為