不同分子量和硫酸化程度肝素組分的抗阿爾茨海默病活性研究.pdf

1、肝素一直以來僅作為抗凝和抗血栓藥物用于臨床，作為一種糖胺聚糖，其結(jié)構(gòu)特點(diǎn)是高分子和高負(fù)電密度;從已經(jīng)闡明的抗凝活性看，其活性是分子量和硫酸基所依賴的。近年來，肝素的抗炎、抗補(bǔ)體激活等非抗凝活性也得到關(guān)注，但尚未得到應(yīng)用。阿爾茨海默病(Alzheimer'sdisease，AD)，又稱早老性癡呆癥，是一種神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病，對(duì)老年人的健康產(chǎn)生極大威脅。AD的特征性病理學(xué)改變?yōu)榇竽X皮質(zhì)神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)神經(jīng)原纖維纏結(jié)、細(xì)胞外大量老年斑形成和大腦皮質(zhì)

2、細(xì)胞減少。β-淀粉樣蛋白(β-amyloid，Aβ)沉積被認(rèn)為是老年斑的主要成分，也是阿爾茨海默病的發(fā)病機(jī)制之一。Aβ的沉積被認(rèn)為是由淀粉樣前體蛋白（amyloid precursor protein，APP）的代謝異常導(dǎo)致的。寡聚化的Aβ和Aβ沉積物又會(huì)引發(fā)對(duì)腦組織的一系列損傷，最終導(dǎo)致AD病變。其中，神經(jīng)炎癥，特別是對(duì)腦內(nèi)補(bǔ)體系統(tǒng)的激活，是Aβ的重要損傷機(jī)制之一。已有研究發(fā)現(xiàn)，肝素對(duì)APP代謝相關(guān)酶有著重要作用，對(duì)AD引起的神經(jīng)炎癥

3、也存在著重要影響，但缺乏系統(tǒng)和深入的研究。本課題利用Aβ?lián)p傷的神經(jīng)元樣細(xì)胞作為細(xì)胞模型，研究不同分子量和硫酸化程度肝素組分對(duì)APP代謝和AD引發(fā)的補(bǔ)體激活的作用，以闡明肝素結(jié)構(gòu)與其抗AD活性的關(guān)系。
　　本課題的研究?jī)?nèi)容及成果主要包括五個(gè)方面:
　　1.AD細(xì)胞模型的構(gòu)建
　　通過RA誘導(dǎo)分化人神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞SH-SY5Y構(gòu)建神經(jīng)元樣細(xì)胞模型。RA處理使SH-SY5Y的形態(tài)發(fā)生明顯變化，形成神經(jīng)元細(xì)胞特有的軸突的結(jié)構(gòu)

4、和細(xì)胞標(biāo)記。利用MTT比色法測(cè)定Aβ1-42對(duì)神經(jīng)元樣細(xì)胞的損傷。確定用濃度為100μg/mL的Aβ1-42處理神經(jīng)元樣細(xì)胞24h可復(fù)制AD樣細(xì)胞模型。
　　2.不同分子量和硫酸化程度肝素組分對(duì)神經(jīng)元樣細(xì)胞和AD樣細(xì)胞存活率的研究
　　利用MTT比色法測(cè)定了不同分子量和硫酸化程度的肝素組分對(duì)神經(jīng)元樣細(xì)胞和AD樣細(xì)胞存活率的影響，包括肝素、依諾肝素、2-O-脫硫酸肝素、6-O-脫硫酸肝素、N-脫硫酸-乙?；嗡亍⒏嗡囟?、肝素

5、四糖、肝素十糖和肝素十六糖。不同肝素組分對(duì)神經(jīng)元樣細(xì)胞存活率沒有顯著性影響。而對(duì)于AD樣細(xì)胞，分子量在3000-5000Da，且含有O-硫酸基和N-硫酸基的肝素組分，如依諾肝素、肝素十六糖等，能顯著提高AD樣細(xì)胞的存活率、抑制Aβ對(duì)神經(jīng)元樣細(xì)胞的損傷的活性在所有肝素組分中。
　　3.不同分子量和硫酸化程度肝素組分對(duì)APP代謝作用的研究
　　首次利用Aβ?lián)p傷的神經(jīng)元樣細(xì)胞作為AD細(xì)胞模型，分析了Aβ1-42對(duì)神經(jīng)元樣細(xì)胞的AP

6、P代謝關(guān)鍵酶、APP和生成的相關(guān)片段的影響，以及肝素及其衍生物對(duì)Aβ1-42引起的上述變化的影響。Aβ1-42顯著提高了BACE1的表達(dá)量，而肝素及其衍生物對(duì)其具有抑制作用，依諾肝素、肝素十糖和肝素十六糖對(duì)BACE-1生成的抑制作用最強(qiáng)。Aβ1-42提高了ADAM10前體及ADAM10表達(dá)量，但并不顯著。結(jié)果提示肝素的硫酸基，特別是6-O-硫酸基和N-硫酸基，分子量在十糖到十六糖長(zhǎng)度的糖鏈對(duì)肝素抑制Aβ引起的APP代謝關(guān)鍵酶表達(dá)是必需的

7、。
　　Aβ1-42提高了AD樣細(xì)胞的APP表達(dá)量，降低了C99的表達(dá)量，而C83的表達(dá)量基本不變，但這些影響并不顯著。2-O-脫硫酸肝素和肝素二糖、四糖、十糖、十六糖使C83表達(dá)量明顯增加，提示肝素對(duì)ADAM10的酶活力可能存在著重要影響。
　　4.不同分子量和硫酸化程度肝素組分對(duì)補(bǔ)體系統(tǒng)作用的研究
　　免疫熒光檢查發(fā)現(xiàn)，Aβ1-42促進(jìn)神經(jīng)元樣細(xì)胞表達(dá)C5b-9，而且封閉CD59對(duì)表達(dá)量并無明顯影響。肝素能抑制Aβ

8、1-42引起的C5b-9表達(dá)。
　　首次利用Aβ1-42損傷的神經(jīng)元樣細(xì)胞作為AD細(xì)胞模型，通過Westernblotting分析了神經(jīng)元樣細(xì)胞細(xì)胞中不同系統(tǒng)相關(guān)蛋白的表達(dá)情況。Aβ1-42顯著促進(jìn)了C4a的表達(dá)，而肝素及其衍生物對(duì)C4a表達(dá)的抑制作用與肝素的硫酸基及分子量密切相關(guān)。6-O-硫酸基和N-硫酸基對(duì)于肝素抑制C4a表達(dá)的活性是必需的。十六糖或以上的肝素糖鏈才可能具有抑制C4a表達(dá)的活性。
　　Aβ1-42也能顯著