細胞因子在雌小鼠內(nèi)毒素攻擊中的變化及其對卵母細胞成熟影響機理的研究.pdf

1、研究背景和研究思路 內(nèi)毒素(endotoxin)是存在于革蘭氏陰性菌外膜中的大分子脂多糖(1ipopolysaccharide,LPS)物質(zhì)，是感染性休克的主要致病因子，而細胞因子如腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor-alpha)、表皮生長因子(epidermal growthfactor,EGF)、內(nèi)皮素-1(endothelin ET-1)、一氧化氮(Nitric oxide，NO)等在介導(dǎo)或保護LP

2、S引起的病理生理學(xué)變化中有著非常重要的作用。故而，阻斷細胞因子引起的炎癥級聯(lián)反應(yīng)，在防治內(nèi)毒素攻擊中具有重要的意義，然而至今尚未尋找到有效的內(nèi)毒素拮抗劑。 雌性激素是存在于女性體內(nèi)的正常激素，包括雌激素(以雌二醇一estradiol,E<,2>為代表)和孕激素(以孕酮—progesterone,P為代表)。 本研究工作分為四個部分： 第一部分探討小鼠動情周期與脂多糖(1ipopolysaccharide，LPS)

3、所致肝 肺組織病理損傷狀態(tài)的關(guān)系及可能的機理；探討動情周期不同階段內(nèi)毒素攻擊 時卵巢中細胞因子含量的變化。 第二部分探討不同劑量內(nèi)毒素(3.0，6.0，12mg／kg)對PMSG和hCG誘導(dǎo)卵泡發(fā)育、成熟和排卵功能的影響和機理，以及E<,2>和P分別及聯(lián)合應(yīng)用時對內(nèi)毒素影響卵泡發(fā)育、成熟和排卵功能的保護性作用。 第三部分用孕馬血清促性腺激素(PMSG)誘導(dǎo)未成年小鼠超排卵，口吸管吸取卵丘一卵母細胞復(fù)合物(COC)以及

4、裸卵(DO)，觀察細胞因子對卵母細胞成熟的影響以及雌性激素的保護性作用。 第四部分用RT-PCR，western blot和顯微注射方法觀察細胞因子影響 卵母細胞成熟的機理以及原癌基因在介導(dǎo)細胞因子影響卵母細胞成熟中的作用。 本實驗通過于動情周期不同階段行LPS攻擊，觀察在體內(nèi)不同E<，2>和P水平時LPS所致肝肺病理損傷的差異，并同步檢測血漿和卵巢中的致炎因子(TNFa)及對機體有重要保護作用的表皮生長因子(EGF)變

5、化，分析它們之間的相關(guān)關(guān)系，為進一步探討雌性激素的保護作用及為臨床上防治內(nèi)毒素損傷提供依據(jù)。 1.實驗動物及動情周期確定成年雌性昆明小白鼠，體重22-25g。用陰道涂片方法確定動情周期，選用處于動情期、動情后期和動情間期的小白鼠用于本實驗。 2．實驗分組 3.形態(tài)學(xué)觀察動物處死后，留取肝、肺組織標(biāo)本，按常規(guī)制片，HE染色，光鏡觀察。 4.逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)測定腹腔巨噬細胞和肝肺、卵巢

6、組織中的TNFαmRNA表達總RNA提取 5．放射免疫法測定小鼠血漿和卵巢組織中EGF、TNF α、ET-1、E<,2>和P含量 按照放免試劑盒說明進行測定。 6．紫外分光比色法測定血漿和卵巢中的NO含量 按照試劑盒說明進行測定。 實驗結(jié)論 動情期和動情后期高水平的E<,2>和P對LPS造成的組織損害有保護作用，其機理可能與降低TNFα、NO或／和ET-1產(chǎn)生和升高EGF產(chǎn)生有關(guān)。在內(nèi)毒素攻擊時，卵巢中細

7、胞因子的水平也產(chǎn)生相應(yīng)的變化。 目的和方法 雌性激素是存在于女性正常體內(nèi)的激素，包括雌激素(以雌二醇E<,2>為代表)和孕激素(以孕酮P為代表)。E<,2>和P除對生殖系統(tǒng)有影響外，還對燒傷、創(chuàng)傷、感染等傷害性刺激造成的免疫系統(tǒng)、神經(jīng)系統(tǒng)、心血管系統(tǒng)和消化系統(tǒng)等的功能紊亂和器質(zhì)性損傷具有重要的調(diào)整和保護作用。內(nèi)毒素是存在于革蘭氏陰性細菌細胞壁外膜中的脂多糖成分，是感染性休克的主要刺激物，也是各種嚴(yán)重損傷時由于腸

8、源性感染、毒素移位等導(dǎo)致膿毒性休克、多功能臟器衰竭等的主要應(yīng)激物。本研究旨在探討：①內(nèi)毒素應(yīng)激時對卵巢的生卵和排卵功能的影響；②雌性激素對內(nèi)毒素引響卵巢生殖功能的保護性作用。 1．實驗設(shè)計 2.放射免疫檢測小鼠血漿中雌二醇和孕酮含量按照放免試劑盒說明進行測定。 3.形態(tài)學(xué)觀察動物處死后，留取卵巢組織，按常規(guī)制片，HE染色，光鏡觀察。 實驗結(jié)論 內(nèi)毒素能干擾小鼠的卵泡發(fā)育和排卵以及卵母細胞的成

9、熟，此作用可能與抑制E<,2>和P產(chǎn)生有關(guān)；外源性E<,2>和P對內(nèi)毒素抑制卵巢的生殖功能具有保護性作用。 第三部分 細胞因子對卵母細胞成熟的影響以及雌性激素的作用 目的和方法 從第一部分結(jié)果可見，在內(nèi)毒素攻擊時，機體的細胞因子產(chǎn)生變化并由之引起肝、肺等組織的病理性損傷，尤其是卵巢中細胞因子也產(chǎn)生明顯的變化；從第二部分結(jié)果可見，在內(nèi)毒素攻擊時，卵泡發(fā)育和卵母細胞的成熟受到嚴(yán)重抑制。從中可以推測，內(nèi)毒素引進的細胞因

10、子尤卵巢中細胞因子的變化可能會對卵母細胞的成熟產(chǎn)生影響，但結(jié)果尚不清楚。本研究探討上述細胞因子對卵母細胞成熟的確切作用，探討雌性激素對細胞因子影響卵母細胞成熟的干預(yù)作用，為進一步了解卵母細胞的成熟機理增添新資料，為證實雌性激素對生殖功能的保護性作用提供實驗依據(jù)。 1．實驗動物模型和復(fù)合卵與的獲取與培養(yǎng)3-4周齡健康雌性未成年昆明小白鼠，腹腔注射PMSG 8IU。 2．實驗設(shè)計 實驗1：觀察小鼠卵母細胞在體外培養(yǎng)條

11、件下的正常發(fā)育過程。以驗證本培養(yǎng)系統(tǒng)的穩(wěn)定性。 實驗2：觀察EGF對小鼠卵母細胞成熟影響的量效關(guān)系和時效關(guān)系。 實驗3：觀察TNF a對小鼠卵母細胞成熟影響的量效關(guān)系和時效關(guān)系以及E<,2>和P的作用。 實驗4：觀察ET-1對小鼠卵母細胞成熟影響的量效關(guān)系和時效關(guān)系以及E<,2>和P的作用。 實驗5：觀察NO對小鼠卵母細胞成熟影響的量效關(guān)系和時效關(guān)系以及E<,2>和P的作用。 3．卵母細胞成熟率的

12、測定 以GVBD作為細胞核成熟的標(biāo)志，PBl作用細胞質(zhì)成熟的標(biāo)志。 實驗結(jié)論 卵母細胞的成熟受多種細胞因子的調(diào)節(jié)，其中EGF和TNFα可直接作用于裸卵，分別對卵母細胞的成熟起促進和抑制作用；ET-1對裸卵無明顯影響，但能呈劑量和時間依賴方式抑制復(fù)合卵母細胞的成熟；小劑量NO供體硝普鈉雖對復(fù)合卵母細胞的成熟無直接作用，但可反轉(zhuǎn)dbcAMP和一氧化氮合成酶抑制劑L-NAME對卵母細胞成熟的抑制作用，大劑量硝普鈉則抑制復(fù)合卵

13、母細胞的成熟。E<,2>和P對TNFα、ET-1和大劑量NO對卵母細胞的抑制作用具有保護效應(yīng)，且似乎E<,2>更偏重于預(yù)防性作用，而P更偏重于治療性作用。 第四部分 原癌基因在介導(dǎo)細胞因子影響 卵母細胞成熟中的作用 目的和方法 細胞因子調(diào)控卵母細胞成熟的機理尚不清楚。本研究探討：①原癌基因c-erbB<,2>、c-myb在卵母細胞成熟中的作用及在介導(dǎo)細胞因子調(diào)控卵母細胞成熟中的作用；②在調(diào)控卵母

14、細胞成熟中原癌基因在細胞因子和MAPK、MPF間是否起某種紐帶作用；③E<,2>或／和P對細胞因子影響卵母細胞成熟的保護性作用是否與原癌基因有關(guān)。 6.實驗設(shè)計 實驗結(jié)論 原癌基因c-erbB<,2>、C-myb在卵母細胞成熟中起著重要的作用，可能是調(diào)控卵母細胞成熟中關(guān)鍵的蛋白激酶如MAPK、MPF的上游激活物，是介導(dǎo)細胞因子和MAPK、MPF間調(diào)控卵母細胞成熟的中間信號物質(zhì)；雌二醇和孕酮對TNFα、ET-

15、1、NO等細胞因子抑制卵母細胞成熟的作用與逆轉(zhuǎn)卵母細胞中c-erbB<,2> mRNA、c-myb mRNA表達和MAPK磷酸化水平及cyclinB1含量下降有關(guān)。 全文總結(jié) 通過以上研究，我們得出如下結(jié)論： 1．小鼠處于動情期和動情后期其體內(nèi)分別含有高水平的E2和P，對內(nèi)毒素造成的肝、肺等組織的損害有保護性作用，保護性作用的機理可能與降低TNFα、NO或／和ET-1產(chǎn)生和升高EGF產(chǎn)生有關(guān)；內(nèi)毒素攻擊時也使卵巢

16、中EGF、TNFα、NO、ET-1等產(chǎn)生相應(yīng)的變化，尤其在動情間期使EGF明顯下降，TNFα、NO和：ET-1明顯上升。 2．內(nèi)毒素能干擾小鼠的卵泡發(fā)育和排卵以及卵母細胞的成熟，此作用可能與抑制E<,2>和P產(chǎn)生有關(guān)；外源性E<,2>和P對內(nèi)毒素抑制卵巢的生殖功能具有保護性作用。 3.卵母細胞的成熟受多種細胞因子的調(diào)節(jié)，其中EGF和TNFα可直接作用于裸卵，分別對卵母細胞的成熟起促進和抑制作用；ET-1對裸卵無明顯影響，

17、但能呈劑量和時間依賴方式抑制復(fù)合卵母細胞的成熟；小劑量NO供體硝普鈉雖對復(fù)合卵母細胞的成熟無直接作用，但可反轉(zhuǎn)dbcAMP和一氧化氮合成酶抑制劑L-NAME對卵母細胞成熟的抑制作用，大劑量硝普鈉則抑制復(fù)合卵母細胞的成熟。 4.用RT-PCR、western blot及顯微注射等多種方法證實，原癌基因c-erbB<,2>、c-myb在卵母細胞成熟中起著重要的作用，可能是調(diào)控卵母細胞成熟中關(guān)鍵的蛋白激酶如MAPK、MPF的上游激活物