銅綠假單胞菌及其胞外產(chǎn)物綠膿菌素誘導(dǎo)人單核細(xì)胞免疫反應(yīng)及在肺部感染中的作用機制.pdf

1、目的： 銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa，PA)是一種定植于支氣管擴張、肺囊性纖維化和慢性阻塞性肺病病人下呼吸道的機會致病菌，可持續(xù)刺激宿主免疫反應(yīng)導(dǎo)致進展性的氣道破壞，具有多重耐藥的特點，一旦感染，臨床治療十分困難。研究發(fā)現(xiàn)，PA可分泌多種毒力因子，導(dǎo)致機體發(fā)病。其中大部分PA分泌一種藍(lán)綠色的色素毒素即綠膿菌素(Pyocyanin，PCN)，存在于CF病人痰液中，能夠促進炎癥反應(yīng)，干擾呼吸道纖毛功能，

2、在急性侵襲性感染中起重要作用。但其作用機制尚不明確，因此探討PA及PCN感染宿主的發(fā)病機制至關(guān)重要。 肺泡巨噬細(xì)胞是重要的防御細(xì)胞及炎癥調(diào)控細(xì)胞，可通過活化NF-κB而啟動大量炎癥介質(zhì)、細(xì)胞因子等合成介導(dǎo)急性肺損傷。而人髓系白血病細(xì)胞系-U937細(xì)胞具有單核母細(xì)胞和未成熟單核細(xì)胞的特征，可被佛波酯(PMA)誘導(dǎo)分化形成單核/巨噬細(xì)胞，因此，U937細(xì)胞是研究人單核/巨噬細(xì)胞分化的較理想模型。PA感染的顯著特征是大量中性粒細(xì)胞(P

3、MN)s在呼吸道表面聚集，發(fā)生嚴(yán)重的炎癥反應(yīng)。IL-6、IL-1β及IL-8為重要的促炎細(xì)胞因子和PMNs趨化因子，IL-8釋放增加是導(dǎo)致感染肺部PMNs增多最主要的原因。研究表明，PA可分泌多種毒力因子誘導(dǎo)呼吸道上皮細(xì)胞及單核細(xì)胞釋放促炎細(xì)胞因子，然而PA活菌及其毒力因子綠膿菌素的體外研究大多集中在氣道上皮細(xì)胞及中性粒細(xì)胞，較少有PCN誘導(dǎo)單核細(xì)胞的報告。至于PA活菌及綠膿菌素能否誘導(dǎo)U937細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞因子IL-8、IL-6等，細(xì)胞

4、內(nèi)信號傳導(dǎo)途徑如何?至今仍不清楚。IL-1β是宿主防御病原菌感染機制中起重要作用的前炎癥細(xì)胞因子，體內(nèi)研究表明內(nèi)源性IL-1活性的減少或消失能抑制炎癥反應(yīng)進而抵抗PA引起的肺炎，提示IL-1β可能參與PA的發(fā)病機制，然而IL-1β 在U937細(xì)胞抗PA免疫反應(yīng)中作用如何?目前尚不明確。 因此本研究探討PA對U937細(xì)胞IL-8及IL-6表達(dá)的誘導(dǎo)作用及綠膿菌素對IL-8表達(dá)的影響及其胞內(nèi)信號傳導(dǎo)通路，并探討IL-1β在U

5、937細(xì)胞抗PA免疫反應(yīng)中的作用。在此基礎(chǔ)上，進一步探討NF-κB及其誘導(dǎo)的細(xì)胞因子在PA感染鼠肺中的表達(dá)及二硫代氨基甲酸吡咯烷(PDTC)對其表達(dá)的影響，從而為臨床治療提供良好的理論依據(jù)。 方法： 實驗分體外和體內(nèi)兩部分進行，以U937細(xì)胞作為體外細(xì)胞模型，SD大鼠作為體內(nèi)模型進行實驗。 1、體外部分 (1)PA采用標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC27853。通過光分解法從吩嗪N-甲硫酸鹽(PMS)中提取PCN，并用反

6、相高效液相色譜儀(HPLC)進一步純化，獲取純化的PCN。 (2)分別用不同濃度的PA活菌{multiplicity of infections(MOI) of PA：U937cells為10：1，20：1及50：1}感染U937細(xì)胞或PMA分化的U937細(xì)胞，PA感染細(xì)胞2h后，收集細(xì)胞，提取總RNA，應(yīng)用RT-PCR法檢測細(xì)胞IL-8及IL-6mRNA表達(dá)。于8、16及24h收集細(xì)胞培養(yǎng)上清，ELISA法檢測細(xì)胞培養(yǎng)上清IL

7、-8及IL-6的濃度變化。 (3)應(yīng)用免疫印記方法檢測PA感染U937細(xì)胞后NF-κB及I-κB蛋白變化。分別于PA感染前60min以不同濃度的PKC活化抑制劑鈣感光蛋白(Cal.C)和NF-κB活化抑制劑PDTC預(yù)處理，然后以PA感染U937細(xì)胞60min(PA:U937為20:1)，收集細(xì)胞蛋白，進行細(xì)胞漿和核蛋白的提取，蛋白定量，免疫印記，并觀察PKC和NF-κB活化抑制劑對其表達(dá)的影響。 (4)應(yīng)用免疫細(xì)胞化學(xué)方

8、法觀察PA刺激U937細(xì)胞后NF-κBp65的蛋白表達(dá)。 (5)分別用不同濃度的綠膿菌素(5、25、50μM)感染PMA分化的U937細(xì)胞，于24h收集細(xì)胞培養(yǎng)上清，ELISA法檢測細(xì)胞培養(yǎng)上清IL-8的濃度變化。綠膿菌素分別感染細(xì)胞1h、2h，收集細(xì)胞，提取總RNA，應(yīng)用RT-PCR法檢測細(xì)胞IL-8mRNA表達(dá)。 (6)應(yīng)用Western blotting方法觀察綠膿菌素(50μM)刺激U937細(xì)胞胞內(nèi)MAPK(p3

9、8MAPK和ERK1/2)通路信號分子的動態(tài)變化以及NF-kB的蛋白表達(dá)，并通過RT-PCR和ELISA方法觀察MAPKs抑制劑PD98059和SB203580以及NF-kB活化抑制劑PDTC對IL-8表達(dá)的影響，進一步證實MAPKs及NF-kB信號傳導(dǎo)通路是否參與了綠膿菌素誘導(dǎo)U937細(xì)胞IL-8的表達(dá)。 (7)作為陽性對照，IL-1β或TNF-α單獨或與綠膿菌素聯(lián)合作用U937細(xì)胞，于2h收集細(xì)胞，提取總RNA，應(yīng)用RT-P

10、CR法檢測細(xì)胞IL-8 mRNA表達(dá)，觀察IL-1β或TNF-α與綠膿菌素在刺激U937細(xì)胞表達(dá)IL-8方面是否具有協(xié)同作用。IL-1β與PA聯(lián)合作用U937細(xì)胞，24h后收集培養(yǎng)上清，于ELISA法檢測細(xì)胞培養(yǎng)上清IL-8的濃度變化，觀察IL-1β在PA感染中的作用。 2、體內(nèi)部分 隨機將72只雄性SD大鼠分為對照組、PA組和PDTC組，每組24只。于對照組和PA組大鼠腹腔分別注射1ml生理鹽水，PDTC組大鼠腹腔注射

11、等容積的PDTC200mg.kg-1。乙醚麻醉大鼠，對照組氣管內(nèi)接種磷酸鹽緩沖液(PBS)0.2ml，PA組和PDTC組分別接種PA懸液0.2ml(6×108CFU/ml)。按PA刺激后不同時間又分為3、6、16、24h亞組，每亞組6只大鼠。觀察大鼠一般狀態(tài)、肺組織形態(tài)學(xué)改變、免疫組織化學(xué)染色及Western blotting檢測肺組織NF-kBp65的蛋白表達(dá)、ELISA法檢測BALF中IL-8的含量。 結(jié)果： 1、體

12、外部分 (1) PA可促進PMA分化的U937細(xì)胞IL-8及IL-6mRNA表達(dá)和蛋白分泌，而且具有明顯的量效和時效關(guān)系。 (2) 重組IL-1β可增強PA誘導(dǎo)PMA分化的U937細(xì)胞產(chǎn)生IL-8。 (3) PA能直接誘導(dǎo)并迅速活化,NF-kB，于PA感染后60min I-kB磷酸化、NF-kB活化明顯，PKC阻斷劑Cal c及NF-kB阻斷劑PDTC均能顯著抑制NF-kB的活化。 (4) PKC阻斷劑C

13、al C及NF-kB阻斷劑PDTC均能以濃度依賴的方式抑制IL-8及IL-6的分泌。 (5) 免疫細(xì)胞化學(xué)方法檢測結(jié)果顯示：正常時，NF-kBp65蛋白在胞漿均勻分布，胞漿內(nèi)呈棕色均勻淡染，PA刺激后1h，NF-kBp65被激活轉(zhuǎn)入核內(nèi)，染色以核明顯，給予Cal C和PDTC預(yù)處理1h后再給予PA刺激，NF-kBp65重新分布于胞漿，胞核也有一定分布。 (6) 綠膿菌素可促進PMA分化的U937細(xì)胞IL-8mRNA的表達(dá)

14、及IL-8的分泌，而且具有明顯的量效和時效關(guān)系。 (7)P38MAPK在加入綠膿菌素后10min表達(dá)明顯增高，30min達(dá)高峰，然后逐漸降低。而10min和30min組分別加入抑制劑SB203580，P38MAPK表達(dá)明顯被抑制，僅可見少量表達(dá)，而總的P38MAPK水平在整個實驗期間內(nèi)無變化。 (8) ERK1/2在加入綠膿菌素后10min表達(dá)明顯增高，30min達(dá)高峰，然后逐漸降低。而10min和30min組分別加入抑

15、制劑PD98059，ERK1/2表達(dá)明顯被抑制，而總的ERK水平在整個實驗期間內(nèi)無變化。 (9) NF-kB p65的蛋白表達(dá)于綠膿菌素感染后30min明顯表達(dá)，60min表達(dá)最為明顯。 (10) 分別用SB203580抑制P38MAPK通路、用PD98059抑制ERK通路、用PDTC抑制NF-kBp65通路，均能引起抑制劑濃度依賴的IL-8蛋白分泌降低。 (11) 綠膿菌素與TNF-α或IL-1β單獨均能誘導(dǎo)U

16、937細(xì)胞表達(dá)IL-8，但綠膿菌素與其分別聯(lián)合未發(fā)現(xiàn)具有協(xié)同作用。 2、體內(nèi)部分 (1) 體內(nèi)動物實驗發(fā)現(xiàn)，PA組大鼠肺組織明顯充血、水腫，大量炎性細(xì)胞浸潤，PDTC預(yù)處理組炎性細(xì)胞浸潤明顯減輕。 (2) 免疫組化顯示3～24h可見NF-kB陽性細(xì)胞表達(dá)，以3h明顯增多。Westernblotting結(jié)果顯示PA組NF-kB的表達(dá)于3h達(dá)高峰。PDTC預(yù)處理組較PA組NF-kB表達(dá)明顯減少(P<0.01)。

17、 (3) IL-8的蛋白分泌于3-24h均增高，IL-8的蛋白分泌量于16h達(dá)高峰。PDTC預(yù)處理組較PA組明顯減少(P<0.01)。 結(jié)論： 1、PA可能通過PKC信號通路促進NF-kB的活化，從而啟動IL-8及IL-6的高效表達(dá)和分泌，加重炎癥反應(yīng)，IL-1β可能在PA炎癥反應(yīng)和免疫應(yīng)答中起著重要的調(diào)節(jié)作用，此項研究可能為預(yù)防和控制PA引起機體炎癥反應(yīng)和炎癥損傷提供新的思路。 2、綠膿菌素與TNF-α或IL