NRSE-RE-1序列與小鼠胚胎干細(xì)胞向神經(jīng)細(xì)胞誘導(dǎo)分化的關(guān)系.pdf

1、神經(jīng)系統(tǒng)疾病嚴(yán)重地威脅著人類的身體健康，其中帕金森病、阿爾茨海默病、脊髓損傷等均是由于受損的分化成熟的神經(jīng)細(xì)胞，不能通過(guò)神經(jīng)細(xì)胞分裂增殖得到修復(fù)所引起。胚胎干細(xì)胞(Embryonic stem cells，ESCs)來(lái)自囊胚內(nèi)細(xì)胞團(tuán)，在體外可長(zhǎng)期自我復(fù)制并且具有分化出三個(gè)胚層細(xì)胞的多潛能性。很多研究表明其可在體外誘導(dǎo)分化為神經(jīng)細(xì)胞，并可將其移植來(lái)修復(fù)神經(jīng)系統(tǒng)的損傷。但是，目前人們?nèi)圆粔蛄私馀咛ジ杉?xì)胞向神經(jīng)細(xì)胞分化的確切機(jī)制。 有

2、文獻(xiàn)報(bào)道，REST/NRSF表達(dá)產(chǎn)物能與神經(jīng)元分化基因啟動(dòng)子區(qū)域的NRSE/RE-1序列結(jié)合，抑制神經(jīng)元分化基因的表達(dá)。在體內(nèi)自然分化的神經(jīng)細(xì)胞中，REST/NRSF表達(dá)明顯下調(diào)，因此認(rèn)為其為神經(jīng)元分化的負(fù)向調(diào)節(jié)基因。 本課題組已建立了將小鼠胚胎干細(xì)胞誘導(dǎo)分化為神經(jīng)元的“序貫誘導(dǎo)”法，并對(duì)胚胎干細(xì)胞向神經(jīng)元分化機(jī)制做初步研究，研究結(jié)果表明： 1、基因表達(dá)芯片研究證實(shí)，REST/NRSF在ESCs向神經(jīng)細(xì)胞分化過(guò)程中明顯降

3、低，而其蛋白作用的含有NRSE/RE-1序列眾多神經(jīng)元分化基因的表達(dá)量卻普遍升高。 2、通過(guò)RNAi技術(shù)直接在轉(zhuǎn)錄水平上干擾REST/NRSF與神經(jīng)元分化基因的結(jié)合，促進(jìn)神經(jīng)元基因的表達(dá)，實(shí)現(xiàn)了mESCs向神經(jīng)細(xì)胞的誘導(dǎo)分化。 本研究選擇了部分含有NRSE/RE-1序列的基因，即P2ry12，Nptxr,Syp，BDNF，Syt2，Syt7，Ntrk3,Cdh4,Cacna2d3，Atp2b2,Rgs7。應(yīng)用real-t

4、ime PCR等方法進(jìn)行精確定量分析其在體外應(yīng)用“序貫誘導(dǎo)法”分化過(guò)程中的表達(dá)變化，研究其在胚胎干細(xì)胞向神經(jīng)元誘導(dǎo)分化的作用機(jī)理，并探討胚胎干細(xì)胞向神經(jīng)元誘導(dǎo)分化的主導(dǎo)基因，及可能的分化標(biāo)志基因。 方法： 1、ESCs培養(yǎng)及誘導(dǎo)分化 ESCs(鼠ES細(xì)胞系A(chǔ)B2.1由美國(guó)南加州大學(xué)醫(yī)學(xué)院惠贈(zèng))按常規(guī)培養(yǎng)于飼養(yǎng)層細(xì)胞上。誘導(dǎo)分化時(shí)去飼養(yǎng)層細(xì)胞，重新接種于無(wú)包被的培養(yǎng)皿中，使用NSC培養(yǎng)液，逐漸更換為無(wú)血清NSC培養(yǎng)

5、液。 2、鑒定未分化及誘導(dǎo)分化后細(xì)胞 (1)堿性磷酸酶染色鑒定未分化ESCs。 (2)免疫熒光法檢測(cè)神經(jīng)干細(xì)胞及成熟神經(jīng)元特異性抗原nestin、NCAM1、NSE、NeuN和GFAP。 (3)NCAM1、DAPI復(fù)染測(cè)定分化比率 3、篩選分化過(guò)程中主導(dǎo)基因 采用real-time PCR法對(duì)篩選出的11個(gè)基因在未分化及分化后第4、10天，定量分析其變化規(guī)律。 結(jié)論： 1、