HSV1 gB、HSV1 gD、HSV2 gD三種蛋白胞外區(qū)抗原性分析及克隆表達、純化鑒定.pdf

1、單純皰疹病毒(Herpes simplex virus，HSV)是危害人類健康的常見病原體，其感染發(fā)病率高，且容易導致復發(fā)性感染和潛伏感染。HSV有1型(HSV1)及2型(HSV2)兩型，HSV1主要引起口面部感染、眼部感染和皰疹性腦炎等；HSV2主要引起生殖器感染，并且和女性宮頸癌的發(fā)生密切相關(guān)。目前國內(nèi)外無HSV疫苗，在積極研制。HSV包膜蛋白在病毒的吸附、入侵和刺激機體產(chǎn)生免疫應答及疫苗研制中具有重要地位，其中g(shù)B蛋白和gD蛋白能

2、誘發(fā)特異性應答，具有重要的抗原表位，是宿主細胞免疫和體液免疫的主要靶標之一，因此gB、gD蛋白是構(gòu)建HSV疫苗的理想抗原。本研究分析篩選HSV1 gD、HSV1 gB、HSV2 gD三種蛋白的抗原表位，利用基因工程技術(shù)表達三種蛋白，為研制重組HSV1型及2型二價疫苗奠定基礎(chǔ)。 通過對HSV1 gB、gD及HSV2 gD三種蛋白的抗原表位分析，篩選三種蛋白含強抗原決定簇較集中的胞外區(qū)片段，選用真核和原核細胞均偏愛的密碼子，并對設(shè)計

3、基因的RNA結(jié)構(gòu)進行優(yōu)化，化學合成HSV1 gB、HSV1 gD、HSV2 gD含信號肽序列的基因序列。 以化學合成的HSV1 gB、HSV1 gD、HSV2 gD含信號肽序列的胞外區(qū)基因序列為模板，用PCR方法擴增HSV1 gB、HSV1go、HSV2gD胞外區(qū)1～696aa、1～284aa、1～284aa的基因片段，并將其插入原核表達載體pGEX－4T－2內(nèi)，獲得的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌TG1，IPTG誘導表達及SDS－PAG

4、E鑒定分析。表達的HSV1gB/GST、HSV1gD/GST、HSV2gD/GST融合蛋白分子量分別為96kd、56kd、56kd。利用親和層析方法，純化獲得可溶性重組HSV1gB、HSV1gD、HSV2gD蛋白。 將純化獲得的融合蛋白HSV1gB/GST倍比稀釋，用Human HSV1ELISA試劑盒檢測表達蛋白HSV1gB/GST的抗原性。將純化獲得的HSV1gD/GST、HSV2gD/GST融合蛋白倍比稀釋，用HRP標記的

5、HSV1+HSV2抗體檢測表達蛋白HSV1gD/GST、HSV2gD/GST的抗原性。結(jié)果顯示，表達的三種融合蛋白具有較好的抗原性和特異性。 將純化后的重組表達蛋白HSV1gD/GST用凝血酶切去GST標簽后作為抗原免疫新西蘭白兔，取兔耳緣靜脈血用間接ELISA法檢測抗HSVgD1抗體效價≥1:64000。表明重組表達蛋白HSVgD1有良好的免疫反應性。 以化學合成的HSV1gB、HSV1gD、HSV2gD含信號肽序列的

6、胞外區(qū)基因序列為模板，PCR擴增HSV1gB、HSV1gD、HSV2gD胞外區(qū)含信號肽序列1-706aa、1-314aa、1-314aa的基因片段，將其插入真核表達載體pcDNA3.1(+)內(nèi)，用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法轉(zhuǎn)染HEK 293細胞，Western Blot分析檢測目的蛋白在胞內(nèi)和胞外的表達。結(jié)果顯示，表達的HSV1gD、HSV2gD蛋白在胞內(nèi)及培養(yǎng)上清內(nèi)均存在，而HSV1gB蛋白未表達。合成HSV1gB蛋白基因不表達提示，在真核表達系統(tǒng)