急性高血壓條件下小鼠足細(xì)胞相關(guān)蛋白podocin、nestin表達(dá)變化的研究.pdf

1、背景：
　　 高血壓腎損傷導(dǎo)致的慢性腎臟病(Chronic kidney diseases,CKD)已成為危害公眾健康的重要病因之一。蛋白尿是CKD的主要臨床表現(xiàn),也是終術(shù)期腎臟病(End stage renal disease,ESRD)的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。減少蛋白尿可以延緩CKD的進(jìn)展,降低ESRD的病死率。因此,研究如何防止和減少蛋白尿的發(fā)生,對(duì)慢性腎臟病的防治具有重要意義。
　　 足細(xì)胞損傷是蛋白尿產(chǎn)生的關(guān)鍵因素,既

2、往研究主要基于遺傳性或獲得性腎病綜合征,發(fā)現(xiàn)足細(xì)胞相關(guān)蛋白如podocin,nestin,nephrin,CD2AP等發(fā)生異常均可導(dǎo)致大量蛋白尿。Podocin是一完整的跨膜蛋白,免疫熒光標(biāo)記顯示,podocin特異的表達(dá)于足細(xì)胞裂孔隔膜上,在其他腎小球細(xì)胞不表達(dá)。Podocin在足細(xì)胞足突發(fā)生及維持裂孔隔膜生理功能方面起關(guān)鍵性的作用,其基因突變可導(dǎo)致以蛋白尿?yàn)橹鞯亩喾N類型的腎小球疾病。巢蛋白(nestin)是一種屬于第vi類的中間絲蛋

3、白,被廣泛用作干細(xì)胞標(biāo)記性蛋白,nestin在足細(xì)胞主要分布于胞質(zhì)和初級(jí)足突,與nestin在干細(xì)胞的表達(dá)不同的是,足細(xì)胞在未完全分化之前不表達(dá)nestin,而只在其分化成熟后才表達(dá),說(shuō)明nestin可能與足細(xì)胞的成熟有關(guān)。近年研究發(fā)現(xiàn),在以足細(xì)胞損傷和大量蛋白尿?yàn)樘攸c(diǎn)的臨床病例中,nestin的表達(dá)明顯減少,說(shuō)明nestin在維持足細(xì)胞功能形態(tài)發(fā)面發(fā)揮著某種重要作用,
　　 血流動(dòng)力學(xué)因素對(duì)小鼠。腎臟結(jié)構(gòu)和功能等方面具有重要影

4、響,且其影響因素瞬息萬(wàn)變,需要采用一種能瞬問(wèn)捕獲組織細(xì)胞原位變化的技術(shù)來(lái)反映活體內(nèi)真實(shí)的病理生理狀態(tài)。本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用活體冷凍技術(shù)(in vivo cryo technique,IVCT)結(jié)合冷凍置換方法,原位保持小鼠腎小球超微結(jié)構(gòu)及組織成分,應(yīng)用共聚焦顯微鏡,免疫電鏡,westernblot,RealTimePCR等手段,可視化急性高血壓等異常血流動(dòng)力學(xué)條件下podocin,nestin的異位分布及表達(dá)變化,探討足細(xì)胞相關(guān)分子在維持足細(xì)胞結(jié)

5、構(gòu)功能中的作用及其在蛋白尿發(fā)生發(fā)展中的機(jī)理。
　　 目的：
　　 探討急性高血壓條件下足細(xì)胞相關(guān)蛋白podocin,nestin的動(dòng)態(tài)分布變化,為進(jìn)一步闡明高血壓導(dǎo)致足細(xì)胞損傷產(chǎn)生蛋白尿的機(jī)制,提高腎小球疾病的病理診斷及靶向治療提供新線索。
　　 方法：
　　 1.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物:昆明小鼠24只,體重20-30克,雌雄不限,由中國(guó)醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物部提供。
　　 2.應(yīng)用HE染色觀察不同血流動(dòng)力學(xué)條件下腎

6、小球的結(jié)構(gòu),免疫組化DAB顯色、間接免疫熒光及免疫電鏡技術(shù)檢測(cè)足細(xì)胞相關(guān)蛋白podocin,nestin的動(dòng)態(tài)分布變化,westernblot及RealTimePCR技術(shù)對(duì)上述兩種蛋白進(jìn)行定量分析。
　　 3.實(shí)驗(yàn)分組:
　　 (1)應(yīng)用IVCT的正常血流組
　　 (2)應(yīng)用IVCT的急性高血壓組(結(jié)扎小鼠左側(cè)腎動(dòng)脈下的腹主動(dòng)脈15分鐘)
　　 (3)應(yīng)用IVCT的停止血流組(腹腔一次性超劑量注入戊巴比妥

7、鈉致使其心臟驟停,導(dǎo)致血液循環(huán)停止)
　　 (4)浸潤(rùn)固定正常血流組及直接切除快速冷凍組(對(duì)照組)。
　　 結(jié)果：
　　 1、不同血流動(dòng)力學(xué)條件下腎小球的結(jié)構(gòu):在正常血流的條件下,腎小囊呈裂隙狀,毛細(xì)血管襻較光滑飽滿,而在急性高血壓條件下,腎小囊和腎小管變得更加擴(kuò)張,相反,在心跳驟停停止血流以及浸潤(rùn)固定正常血流的條件下,腎小球毛細(xì)血管襻閉塞。
　　 2、足細(xì)胞相關(guān)蛋白podocin,nestin在腎小球的

8、分布:正常血流條件下,podocin,nestin均沿著腎小球毛細(xì)血管襻表達(dá),分布均勻,共聚焦掃描顯微鏡顯示了二者的共同表達(dá)位點(diǎn)。急性高血壓條件下,podocin,nestin的表達(dá)位點(diǎn)不同程度的發(fā)生改變,二者的共同表達(dá)位點(diǎn)明顯減少。而在心跳驟停停止血流及浸潤(rùn)固定正常血流組,二者的表達(dá)紊亂,分布不均。
　　 3、急性高血壓條件下足細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)分析及podocin,nestin的表達(dá):急性高血壓條件下,足細(xì)胞足突出現(xiàn)不同程度的融合

9、,致使podocin,nestin異位表達(dá)在足突的基底部。
　　 4、不同血流動(dòng)力學(xué)條件下足細(xì)胞相關(guān)蛋白podocin,nestin的定量分析:在蛋白水平,異常血流動(dòng)力學(xué)條件下,如急性高血壓、停止血流等能夠?qū)е聀odocin,nestin的表達(dá)減少(P＜0.05),與此一致,上述兩種足細(xì)胞蛋白mRNA表達(dá)減弱(P＜0.01),其中以組織直接切除的影響最大。
　　 結(jié)論：
　　 1、“活體冷凍技術(shù)”能更好的保存腎小