急性高血壓條件下足細胞整合素β1及FAK表達變化的研究.pdf

1、足細胞是位于腎小球基底膜(Glomerular basement membrane，GBM)外側的終末分化期細胞。它是蛋白尿漏出的最后一道屏障，所以足細胞損傷可以產生蛋白尿[1]。在許多人類及動物腎小球疾病模型中已證實足細胞的損傷，高血壓腎損傷就是其中之一。
　　 作為足細胞和GBM之間的重要黏附分子，整合素α3β1的減少是蛋白尿產生的重要原因之一。整合素α3β1是一類細胞表面的糖蛋白，它是由α與β兩種亞基通過非共價鍵構成，其中

2、α亞基相對β亞基大[5]。在不同的外界刺激作用下，整合素α3β1結合不同的配體，包括層黏連蛋白(Laminin)、纖維連接蛋白(fibronectin)和膠原(collagen)，從而向細胞內傳導不同的信號[6]。這是以細胞外基質(Extracellular Matrix，ECM)、整合素α3β1和骨架蛋白組成的焦點黏附物為結構基礎實現的。許多信號蛋白通過與焦點黏附物結合，在整合素介導的信號轉導中發(fā)揮作用。局部黏附激酶(Focal Ad

3、hesion Kinase，FAK)就是細胞內一個重要的信號蛋白，它是一個非受體型酪氨酸激酶。酪氨酸397位點是FAK的重要磷酸化位點，它是通過一些激活蛋白（如整合素的胞漿端等）取代FERM區(qū)域的位置從而破壞了FERM和激酶區(qū)之間的自身抑制作用實現的。已有報道，磷酸化的FAK在足細胞損傷過程中明顯增加，而且抑制FAK的激活可以減少蛋白尿的產生和足細胞的融合[7]。在高血壓心力衰竭動物模型中，人們發(fā)現FAK和磷酸化FAK的表達明顯增加并表

4、現出明顯的核內聚集[8，9]。但是這些發(fā)現都是在慢性疾病中或者制造動物模型后很長時間觀察到的。而在異常血流動力學變化早期腎小球整合素β1以及FAK的瞬間表達變化還未見報道。
　　 血流動力學因素對小鼠腎臟結構和功能等方面具有重要的影響[10-12]，且其影響瞬息萬變，需要應用一種能瞬間捕獲組織細胞原位變化的技術來反映活體內真實的病理生理狀態(tài)。使用傳統(tǒng)的固定組織方法是難以實現的[13]。而采用“活體冷凍技術”(in vivo cr

5、yotechnique，IVCT)結合冷凍置換方法能使活體小鼠腎臟內所有生物進程被即刻停止。我們課題組已成功應用IVCT觀察到異常血流動力學條件下血清蛋白在腎小球中的分布變化[14]。以上研究充分說明活IVCT是一項觀察異常血流動力學條件下腎小球結構和功能變化的可靠方法。
　　 本研究應用IVCT結合免疫組化、共聚焦顯微鏡、免疫電鏡、western blot等技術觀察異常血流動力學條件下整合素β1和FAK的變化，為進一步闡明蛋白

6、尿的產生機制提供依據。
　　 目的：
　　 本研究旨在探討不同血流動力學條件下足細胞基底膜黏附蛋白整合素β1、相關信號分子FAK的分布變化，為進一步闡明蛋白尿的產生機制，尋求新的蛋白尿的治療方法提供依據。
　　 方法：
　　 1.實驗動物:昆明小鼠20只，體重20-30克，雌雄不限，由中國醫(yī)科大學實驗動物部提供。
　　 2.實驗分組:
　　 (1)應用IVCT固定的正常血流組
　　

7、 (2)應用IVCT固定的急性高血壓組（結扎小鼠左側腎動脈下的腹主動脈10分鐘）
　　 (3)應用IVCT固定的停止血流組（腹腔一次性注入超劑量戊巴比妥鈉致使心臟驟停，導致血液循環(huán)停止）
　　 (4)侵潤固定正常血流組及直接切除快速冷凍組（對照組）
　　 3.應用HE染色、免疫組化DAB顯色、間接免疫熒光及免疫電鏡技術觀察腎小球的結構變化以及整合素β1和FAK的動態(tài)變化，應用western blot技術對上述蛋白

8、進行定量分析，同時應用免疫組化DAB顯色法觀察酪氨酸397磷酸化FAK(pTyr397FAK)的變化。
　　 結果：
　　 1.不同血流動力學條件下腎小球的結構變化:在正常血流動力學條件下，腎小囊呈裂隙狀，毛細血管較光滑飽滿;而在急性高血壓條件下，腎小囊和腎小管變得更加擴張;相反，在停止血流組以及浸潤固定正常血流的條件下，腎小球毛細血管襻閉塞。另外，在活體冷凍固定組的腎小球毛細血管內均可見不同數量的紅細胞存在，而在侵潤固

9、定組幾乎未見紅細胞存在。
　　 2.足細胞整合素β1、FAK與pTyr397FAK在腎小球的分布變化:正常血流條件下，整合素β1沿著基底膜呈線性分布，分布均勻;FAK和pTyr397FAK在足細胞的胞漿和胞核中均勻分布。在急性高血壓條件下，三者的表達均明顯減少，整合素β1呈斷續(xù)分布，部分染色缺失;在異常血流組和浸潤固定組FAK和pTyr397FAK的表達進一步減少并出現不均勻表達。而整合素β1在浸潤固定組較活體冷凍組的表達明顯增

10、多。共聚焦顯微鏡進一步證明了整合素β1和FAK在足細胞的分布，同時可以看到兩者共同表達位點在異常血流動力學條件下減少且不均勻。
　　 3.急性高血壓條件下足細胞超微結構分析及整合素β1、FAK的分布和表達變化:急性高血壓條件下，足細胞足突出現不同程度的融合，并且出現整合素β1從足突側部向基底部，FAK從胞漿向胞核的移位聚集現象。
　　 4.不同血流動力學條件下整合素β1、FAK的定量分析:在急性高血壓、停止血流和直接切除

11、組上述蛋白表達均明顯減少(P＜0.05)。而且FAK在異常血流動力學條件下表現出明顯核內聚集現象，其中直接切除組的變化最大。
　　 結論：
　　 1.急性高血壓能夠造成足細胞損傷，致使足突融合，整合素β1和FAK的異位表達。
　　 2.異常血流動力學條件可導致整合素β1、FAK蛋白在腎臟的表達減少。
　　 3.整合素β1、FAK、pTyr397FAK的分布和表達變化，在調節(jié)異常血流動力學條件下的足細胞功能