應(yīng)用活體冷凍技術(shù)研究急性高血壓條件下小鼠腎臟足細(xì)胞裂孔隔膜蛋白表達(dá)及再分布的變化.pdf

1、目的:
　　 腎小球足突細(xì)胞及其足突間的裂孔隔膜構(gòu)成腎小球?yàn)V過(guò)屏障最重要的部分。近年來(lái)，已先后確定了多個(gè)位于足突細(xì)胞及裂孔隔膜的蛋白分子如Nephrin、Podocin和α-actinin-4等，而腎小球?yàn)V過(guò)屏障中裂孔隔膜的結(jié)構(gòu)和功能的完整對(duì)蛋白尿的發(fā)生尤為關(guān)鍵。并證實(shí)這些分子對(duì)維系裂孔隔膜正常結(jié)構(gòu)和濾過(guò)屏障的功能起關(guān)鍵作用。
　　 血液動(dòng)力學(xué)因素在影響小鼠腎臟結(jié)構(gòu)和功能等方面發(fā)揮著重要作用，其影響因素瞬息萬(wàn)變，而活體冷

2、凍技術(shù)”(in vivo cryotechnique，IVCT)的應(yīng)用能夠捕獲瞬間活體小鼠腎臟超微結(jié)構(gòu)[7]，能夠原位(in situ)保留細(xì)胞和組織成分揭示其活體結(jié)構(gòu)功能。
　　 本項(xiàng)研究采用“活體冷凍技術(shù)”結(jié)合冷凍置換方法，觀察急性高血壓等血液動(dòng)力在學(xué)改變的情況下，裂孔膜相關(guān)蛋白Nephrin、CD2AP的分布變化，并利用Real-time RT-PCR、免疫組織化學(xué)方法以及應(yīng)用免疫電鏡等技術(shù)，對(duì)它們化免疫定位、定量分析，探

3、討異常血液動(dòng)力學(xué)情況下裂孔膜的相關(guān)蛋白復(fù)合體之間分布變化規(guī)律，探討其在蛋白尿發(fā)生發(fā)展中的分子生物學(xué)行為及其機(jī)理，為進(jìn)一步闡明蛋白尿的發(fā)生機(jī)制，提供新線索。
　　 方法:
　　 成年昆明小鼠15只，體重20-30克，雌雄不限，隨機(jī)平均分為三組：應(yīng)用IVCT的急性高血壓組（活體麻醉狀態(tài)下，結(jié)扎小鼠左側(cè)腎動(dòng)脈下的腹主動(dòng)脈15分鐘，活體內(nèi)冷凍取材）、正常血流組和常規(guī)浸泡固定正常血流組（對(duì)照組）。進(jìn)行常規(guī)HE染色，免疫組化染色，和

4、免疫電鏡觀察并應(yīng)用real time RT-PCR對(duì)相關(guān)蛋白進(jìn)行定量分析。
　　 結(jié)果:
　　 1、HE染色結(jié)果
　　 采用活體冷凍技術(shù)獲得的小鼠腎皮質(zhì)保存完好。在急性高血壓情況下，包曼囊腔和近端或遠(yuǎn)端小管的管腔開(kāi)放程度比正常血壓條件下更明顯。
　　 2、免疫組化染色結(jié)果
　　 活體冷凍組正常血流與常規(guī)浸入固定正常血流組CD2AP Nephrin表達(dá)沿腎小球毛細(xì)血管壁，呈均勻、線狀分布；活體冷凍高

5、血壓組CD2AP Nephrin在腎小球中分布不均勻，呈顆粒狀或者團(tuán)塊狀，部分區(qū)域染色明顯減弱，部分區(qū)域線性消失。
　　 3、免疫電鏡結(jié)果
　　 CD2AP和Nephrin兩組活體冷凍高血壓組與活體冷凍正常血流組比較，足突結(jié)構(gòu)破壞，兩種蛋白異位含量減少。
　　 4、Westenblot結(jié)果
　　 各組均有CD2AP和Nephrin蛋白表達(dá)，與常規(guī)浸入固定正常血流組相比，活體冷凍正常血流組蛋白表達(dá)均高，活體

6、冷凍高血壓組蛋白表達(dá)均低于活體冷凍正常組(P＜0.05，P＜0.05)。
　　 5、RT-PCR結(jié)果
　　 RT- PCR：mRNA表達(dá)水平與其蛋白相一致，與常規(guī)浸入固定正常血流組相比，活體冷凍正常血流組蛋白表達(dá)均高，活體冷凍高血壓組蛋白表達(dá)均低于活體冷凍正常組(P＜0.05，P＜0.05)。
　　 結(jié)論:
　　 1．“活體冷凍技術(shù)”的應(yīng)用更客觀地反映急性高血壓等血液動(dòng)力學(xué)條件下腎小球內(nèi)瞬時(shí)生理與病理生理