應用活體冷凍技術研究心外膜下微環(huán)境及不同血流動力學條件下心肌細胞變化.pdf

1、前言:眾所周知,心血管微循環(huán)的異常和心肌細胞周圍微環(huán)境的改變是很多心血管疾病的一個重要特點,活體動物體內的血漿成分是組成細胞組織微環(huán)境的重要成分之一,動態(tài)變化的微環(huán)境可以相應地反映細胞和組織的各種生理和病理狀態(tài)。然而,用傳統(tǒng)的組織制備方法,如浸泡固定方法,在其制備過程中因需要先將組織從活體動物體內切割下來,導致了血液循環(huán)的喪失和組織缺血缺氧,而灌流固定方法,一方面因灌流使血管內所有成分沖失,另一方面較高的灌流壓也可能會導致血漿蛋白移位等

2、人工假象,此外,上述固定方法后的組織溶劑逐級脫水過程中還會引起組織皺縮的人工假象,因此很難從功能形態(tài)學和免疫組織化學方面原位檢測活體動物組織內可溶性成分的定位。
　　 近十余年來,一項新的用于活體動物器官的組織制備方法,活體冷凍技術(IVCT),因其能克服上述傳統(tǒng)固定方法中存在的上述問題而逐漸得到越來越多的關注。IVCT采用液體冷凍劑(-193℃),以104-105K/s的冷凍速度即刻將活體動物的細胞和組織冷凍固定在原位,能保存

3、即刻的血流狀態(tài)和瞬間的分子結構。在過去的數十年間,IVCT已經被用于即刻冷凍活體動物的任何靶器官,即刻捕獲瞬間發(fā)生的分子移動,原位保存各種細胞組織的細胞核內可溶性成分,如活體小鼠視網膜內快速的磷酸化信號,小鼠小腦內可溶性細胞核內信號等。因此,IVCT能可靠的保存生物組織的超微結構和各種成分,避免動物死后因蛋白酶作用引起的組織降解以及血液循環(huán)缺失引起的改變。此外,應用IVCT時組織細胞內形成的細胞內微小冰晶形成有孔的網狀結構,有利于暴露細

4、胞核內的抗原分子,通過增加抗體的滲透性增加了抗原性。IVCT之后無水固定劑(含2％多聚甲醛的丙酮溶液)的冷凍置換在將冷凍的組織細胞固定的同時在低溫下將冰晶置換出來,避免了組織細胞內水溶性成分的丟失和移位。因此,IVCT和之后的冷凍置換是一種能更精確檢測組織內動態(tài)改變的微循環(huán)和更可信的反映可溶性血漿蛋白定位的方法,因此也是檢測活體動物心臟組織內動態(tài)變化的微環(huán)境和微循環(huán)的理想選擇。
　　 在目前的研究中,我們應用IVCT技術從功能形

5、態(tài)學和免疫組織化學方面檢測了活體小鼠心臟在生理和各種病理情況下心外膜下的血流、構成心肌細胞周圍微環(huán)境的血漿蛋白的免疫定位、微血管滲透性、紅細胞變形性和T小管網的變化,闡述了心肌閏盤及T小管對血漿蛋白分子大小的選擇性,及外源性血漿蛋白BSA注射后的時間依賴性分布及其對內源性蛋白分布的一過性影響。
　　 目的:
　　 對比傳統(tǒng)組織制備方法與活體冷凍技術(IVCT)在檢測小鼠心臟正常生理和病理狀態(tài)下心外膜下的血流、構成心肌細胞

6、周圍微環(huán)境的血漿蛋白的免疫定位、微血管滲透性、紅細胞變形能力、閏盤和T小管網方面的異同,進一步應用IVCT技術檢測在各種病理條件下上述指標的變化以及在外源性血漿蛋白BSA注射后,BSA的時間依賴性分布情況及其對內源性血漿蛋白分布的一過性影響,為通過功能形態(tài)學和免疫組織化學來真實反映活體狀態(tài)下的心臟微循環(huán)和微環(huán)境提供新的研究方法和依據。
　　 方法:
　　 一、動物與實驗設計實驗動物來源于中國醫(yī)科大學實驗動物中心。昆明小鼠

7、,體重20-25克,雄性。每組4只小鼠。實驗1共4組:IVCT組,浸泡固定組,灌流固定組,快速冷凍組。實驗2共7組:生理鹽水(Saline)尾靜脈注射組,牛血清白蛋白(BSA:濃度為100mg/ml)尾靜脈注射5min組,30min組,4h組,8h組,48h組,以及BSA濃度4mg/ml尾靜脈注射4h組。每只小鼠的尾靜脈注射量為50μl。實驗3共4組:正常生理狀態(tài)組(IVCT-N),腎上腹主動脈結扎導致急性左室后負荷增高組(IVCT-L

8、AA),心臟左前降支結扎引起的急性心肌缺血組(IVCT-IC),過量麻醉劑引起心臟驟停組(IVCT-HA)。
　　 二、組織制備方法
　　 (一)IVCT與冷凍置換小鼠空腹12小時,戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉(100mg/kg體重)。之后用226的靜脈包埋針的塑料套管給小鼠做氣管插管接小動物呼吸機進行機械通氣。開胸暴露心臟,將預先在液態(tài)氮(-196℃)中預冷的異戊烷-丙烷制成的冷凍劑(-193℃)直接傾倒在小鼠跳動的心臟組織

9、表面,然后迅速移到液態(tài)氮中。在液態(tài)氮中分離心臟組織,移到由干冰丙酮制冷的含2％多聚甲醛的純丙酮溶液中(-80℃)進行冷凍置換48h,之后分別在-30℃,-10℃,4℃和室溫下各置換2h。純丙酮脫水3次,每次1小時。二甲苯透明,低溫石蠟(50℃-52℃)溫箱(60℃)過夜,混合蠟(56℃-58℃石蠟與低溫石蠟按3:1混合)孵育6h后包埋。
　　 (二)浸泡固定空腹12小時的小鼠如前麻醉后將心臟直接剪除迅速浸泡在2％多聚甲醛中過夜,

10、常規(guī)酒精逐級脫水,石蠟包埋(方法同前)。
　　 (三)灌流固定空腹小鼠常規(guī)麻醉后2％多聚甲醛(溶于0.1M磷酸緩沖液中,pH7.4)左心尖處灌流后剪下心臟浸泡在相同的固定劑中過夜,常規(guī)酒精逐級脫水,石蠟包埋(方法同前)。
　　 (四)切除心臟的快速冷凍空腹小鼠麻醉后迅速切除心臟,立刻浸泡到異戊烷-丙烷制成的冷凍劑中,之后用液態(tài)氮冷凍后,放入含2％多聚甲醛的純丙酮溶液中進行冷凍置換和石蠟包埋(方法同前)。
　　 (

11、五)BSA尾靜脈注射生理鹽水或濃度為100mg/ml的牛血清白蛋白(BSA)50μl尾靜脈注射。分別在BSA注射后的5min,30min,4h,8h,48h做IVCT組織制備方法。另外,濃度為4mg/ml的BSA在注射4h后進行IVCT制備,注射劑量同前。
　　 (六)病理模型的制備
　　 1、正常對照組(IVCT-N):方法同1(IVCT與冷凍置換)。
　　 2、腎上腹主動脈結扎致急性左室后負荷增高組(IVCT

12、-LAA):空腹小鼠常規(guī)麻醉,氣管插管機械通氣后,暴露腹腔,5-0手術線結扎腎上腹主動脈10min。之后在小鼠心臟上執(zhí)行IVCT操作(方法同前)。
　　 3、左心室冠狀動脈前降支結扎致急性心肌缺血組(IVCT-IC):空腹小鼠常規(guī)麻醉,氣管插管機械通氣后,打開胸腔,暴露心臟,8-0帶針手術線結扎左心室冠狀動脈前降支10min后,進行IVCT操作(方法同前)。
　　 4、麻醉劑過量致心臟驟停組(IVCT-HA):空腹小鼠常

13、規(guī)麻醉,氣管插管機械通氣后,打開胸腔,暴露心臟,再給予大量麻醉劑腹腔注射致心臟驟停,進行IVCT操作(方法同前)。
　　 三、組織學染色
　　 1、蘇木素-伊紅(HE)染色:3μm厚的石蠟切片常規(guī)去石蠟后做HE染色。
　　 2、免疫組織化學染色:3μm厚的連續(xù)石蠟切片常規(guī)去石蠟后做血清白蛋白(Albumin),免疫球蛋白(IgG)或免疫球蛋白重鏈(IgG1),牛血清白蛋白(BSA),及連接蛋白-43(Connex

14、in43)染色。
　　 3、免疫熒光染色:3μm厚的石蠟切片常規(guī)去石蠟后分別做Albumin-IgG(或IgG1)、Albumin-Connexin43、IgG1-Connexin43、BSA-Connexin43雙重熒光染色。
　　 四、統(tǒng)計學分析本研究對四種不同組織制備方法獲得的HE染色的小鼠心臟組織切片上的紅細胞的數量,以及Albumin、BSA、IgG1或IgG的免疫定位的染色強度進行了半定量分析。分別從四種不同

15、組織制備方法組,BSA尾靜脈注射組及其對照組隨機抽取HE染色或Albumin、BSA、IgG1或IgG免疫染色的心臟組織切片的顯微照片(500μm×200μm),每只鼠樣本10張。記錄每張HE染色顯微照片上的紅細胞數量。血管、間隙、閏盤、T小管和心肌細胞漿內的免疫染色強度分為5級:陰性(-),弱陽性(±),陽性(+),中強度陽性(2+),強陽性(3+)。結果分別來自3名觀察者。我們還對IgG免疫染色的微血管用Chalkley方法進行了微

16、血管容量的對比。統(tǒng)計分析用SPSS-11.5軟件進行非參數Kruskal-Wallis的H檢驗。P＜0.05為有統(tǒng)計學意義。
　　 結果:
　　 一、不同組織制備方法的比較HE染色結果顯示,IVCT制備的小鼠心肌組織樣本的切片上,大量具有方向性的流動狀態(tài)的降落傘型紅細胞保存在豐富的心肌細胞間的各級血管內,降落傘型紅細胞的頂端指向血流方向。橫跨心肌的心肌橋狀微血管、微血管分支和匯合處、以及分支和合流處微血管的血流方向清晰可

17、見。心肌細胞界限清晰,可見心肌細胞間的閏盤結構。IM-DH制備的心肌組織樣本切片上,紅細胞數量明顯減少,其形態(tài)為靜止狀態(tài)的雙凹圓盤狀。各級血管塌陷,部分微血管內的紅細胞缺失。心肌細胞腫脹,閏盤顯示不清。PF-DH制備的心肌組織樣本切片上,因灌流使紅細胞被沖走而缺如,血管擴大,心肌細胞間的閏盤結未顯示。QF的心肌組織樣本與IVCT相似,但因組織切割引起的缺血缺氧和血液循環(huán)的喪失,部分紅細胞聚集。
　　 免疫染色結果顯示,IVCT制

18、備的小鼠心肌組織樣本切片上,Albumin分布在血管、間隙、閏盤和T小管處,而IgG或IgG1僅分布在血管和間隙處。IM-DH或PF-DH心肌組織樣本切片上,Albumin和IgG或IgG1的免疫定位不清晰,并且部分血漿蛋白移位或彌散到心肌細胞漿內。
　　 二、內源性和外源性血清蛋白的時間依賴性分布BSA注射5min后,BSA僅分布在血管內,30min后BSA與內源性Albumin分布一致,分布在血管、間隙、閏盤和T小管,48h

19、后BSA僅分布在血管,逐漸從T小管、閏盤、間隙內消失。BSA注射后隨時間延長IgG1的免疫反應強度增加。BSA注射4h后,在閏盤處IgG1的免疫反應顯示陽性,而BSA注射8h后,這一免疫陽性反應消失。
　　 為了明確BSA注射4h后IgG1進入閏盤是否與BSA的濃度相關,我們進行了不同濃度BSA注射4h后的免疫檢測。結果顯示,濃度為4mg/ml的BSA注射4h后,BSA和IgG1僅免疫定位在血管和間隙,而濃度為100mg/m的B

20、SA注射4h后,BSA和IgG1除了免疫定位在血管和間隙外,均進入閏盤和T小管。
　　 三、不同病理條件下的形態(tài)學改變和血漿蛋白定位在均應用IVCT制作的小鼠心肌組織樣本的切片上,與生理狀態(tài)相比,急性左室后負荷增高(IVCT-LAA)的心肌組織切片顯示,T小管紊亂,相距變窄,網狀結構顯示不清。而急性心肌缺血(IVCT-IC)的心肌組織切片顯示,T小管紊亂,間距變寬,網狀結構顯示不清,部分血漿蛋白漏出彌散到心肌細胞漿內。心臟驟停(

21、IVCT-HA)的心肌組織切片上,無血漿蛋白的漏出移位,T小管結構顯示不清。
　　 結論:
　　 1、IVCT技術能顯示活體小鼠心肌組織的微循環(huán)血流狀態(tài)、可溶性的微環(huán)境成分的變化和超微組織結構的功能形態(tài)學。
　　 2、生理狀態(tài)下,血漿白蛋白可分布在心肌細胞間的閏盤處和心肌細胞表面的T小管內,是構成心肌細胞周圍微環(huán)境的成分之一。
　　 3、閏盤和T小管對血漿蛋白具有分子大小選擇性。
　　 4、高濃度