二氯二苯三氯乙烷（DDT）對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)氧化—抗氧化系統(tǒng)的影響及抗氧化劑tBHQ的干預(yù)作用.pdf

1、二氯二苯三氯乙烷(dichloro-diphenyl-trichloroethane，DDT)，商品名：滴滴涕。它是有機(jī)氯農(nóng)藥的代表之一，我國在上世紀(jì)50-80年代大量使用這種農(nóng)藥，由于DDT的高殘留、難降解的特性，其對(duì)環(huán)境造成嚴(yán)重的污染是不言而喻的。雖然對(duì)于DDT早已禁止使用，但是其在環(huán)境中難降解，對(duì)于DDT可能造成人類健康的潛在危害仍不容忽視。例如近年來很多學(xué)者認(rèn)為，神經(jīng)退行性病變發(fā)病的增高與環(huán)境污染有關(guān)。帕金森病(Parkinso

2、n'sdisease，PD)發(fā)病率與當(dāng)?shù)氐臍⑾x劑的銷售量及伐木場蔬菜場的分布呈明顯的劑量—效應(yīng)相關(guān)趨勢。Semchuk等以人群為基礎(chǔ)的病例—對(duì)照研究發(fā)現(xiàn)，除草劑和殺蟲劑的使用是PD的危險(xiǎn)因素，且與田間勞動(dòng)生活的時(shí)間長短呈劑量—反應(yīng)關(guān)系，但在控制可能的混雜因素后殺蟲劑的使用成為唯一的危險(xiǎn)因素。 氧化應(yīng)激在神經(jīng)毒性機(jī)制研究中占有重要地位，它能很好地解釋遲發(fā)性和蓄積性神經(jīng)損害，近年來倍受關(guān)注，是目前神經(jīng)毒理學(xué)研究的熱點(diǎn)之一。而且現(xiàn)在越

3、來越多的研究報(bào)告表明，氧化應(yīng)激的發(fā)生與很多神經(jīng)系統(tǒng)的退行性疾病(如帕金森病、亨廷頓病、阿爾茲海默病、多發(fā)性硬化等)有關(guān)，可能是這些疾病發(fā)生與發(fā)展的重要原因。過去對(duì)DDT的研究主要集中在它的肝臟毒性、生殖毒性和內(nèi)分泌干擾效應(yīng)，對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)方面的研究報(bào)道比較少，主要是有關(guān)體外電生理實(shí)驗(yàn)以及黑質(zhì)—紋狀體的多巴胺能神經(jīng)通路的研究。至于DDT對(duì)神經(jīng)組織的氧化—抗氧化系統(tǒng)的影響，未見有相關(guān)的報(bào)道。因此，本次研究選擇成年雄性SD大鼠的大腦皮層、海馬和小

4、腦為研究對(duì)象，通過整體實(shí)驗(yàn)DDT染毒，觀察不同腦區(qū)的氧化—抗氧化相關(guān)指標(biāo)的變化；另外，在體外實(shí)驗(yàn)條件下，以PC12細(xì)胞為研究模型，探討DDT對(duì)氧化—抗氧化系統(tǒng)的影響，并通過引入一種人工合成的酚型強(qiáng)抗氧化劑和代謝酶的誘導(dǎo)劑—叔丁基對(duì)苯二酚(tertiary-Butylhydroquinone，tBHQ)，觀察它對(duì)DDT誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激是否具有拮抗作用，為DDT中毒的預(yù)防和治療提供理論依據(jù)。 第一部分滴滴涕對(duì)大鼠不同腦分區(qū)的氧化應(yīng)激影

5、響 目的：初步探討滴滴涕對(duì)雄性SD大鼠神經(jīng)組織氧化—抗氧化系統(tǒng)的毒性作用 方法：采用不同劑量的DDT(20mg/kg、40mg/kg、80mg/kg)對(duì)雄性SD大鼠連續(xù)7d經(jīng)口灌胃給藥后，采用分光光度法分別檢測其大腦不同區(qū)域皮層、海馬和小腦內(nèi)的MDA含量以及酶性抗氧化系統(tǒng)中的超氧化物歧化酶(superoxidedismutase，SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶(glutathioneperoxidase，GSH-PX)、谷

6、胱甘肽還原酶(glutathionereductase，GR)和谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶(glutathione-S-transferases，GST)的活性。 結(jié)果：隨著DDT劑量的增加，與溶劑對(duì)照組比較：①大鼠大腦皮層、海馬和小腦中MDA含量升高，T-SOD活性下降；②大腦皮層GSH-PX活性在低劑量時(shí)升高，在中、高劑量組則顯著下降，海馬GSH-PX活性隨著劑量的增加而顯著下降，而小腦GSH-PX活性則在中、高劑量組出現(xiàn)顯高，高

7、劑量組著下降；③海馬GR活性在中、高劑量組隨著劑量的增加而顯著下降，在小腦則只有高劑量組出現(xiàn)了下降，皮層GR活性在各劑量組未觀察到明顯改變；④皮層GST活性在低、中劑量組升變化不明顯，在海馬，所有劑量組的GST活性均顯著升高，小腦GST活性在中劑量組升高，在高劑量組顯著下降。 結(jié)論：DDT可以引發(fā)神經(jīng)組織的脂質(zhì)過氧化反應(yīng)增強(qiáng)，且有劑量反應(yīng)關(guān)系。DDT導(dǎo)致機(jī)體組織的氧化損傷可能在動(dòng)物神經(jīng)毒性中起重要作用。 第二部分滴滴涕對(duì)

8、大鼠神經(jīng)組織活性氧生成的影響 目的：在已知DDT引起氧化損傷的基礎(chǔ)上，研究滴滴涕對(duì)雄性SD大鼠大腦皮層、海馬和小腦活性氧生成的影響，試圖了解產(chǎn)生氧化損傷的機(jī)制。 方法：采用不同劑量的DDT(20mg/kg、40mg/kg、80mg/kg)對(duì)雄性SD大鼠連續(xù)7d經(jīng)口灌胃給藥后，熒光分光光度法分別檢測大腦皮層、海馬和小腦內(nèi)的活性氧(ReactiveOxygenSpecies，ROS)含量。 結(jié)果：在大腦皮層，20、4

9、0和80mg/kg劑量組的活性氧含量均比對(duì)照組有顯著性升高(P＜0.05)，80mg/kg組ROS含量比40mg/kg組高出37％(P＜0.05)，但與20mg/kg組相比，無顯著性差異。在海馬，除了在80mg/kg組出現(xiàn)了與對(duì)照組和20mg/kg組相比的顯著性升高外(P＜0.05)，20、40mg/kg組與對(duì)照組相比僅出現(xiàn)—升高趨勢，其差異無顯著性意義。在小腦，20、40和80mg/kg劑量組的活性氧含量均比對(duì)照組有顯著性升高(P＜0

10、.05)，但三個(gè)劑量組之間的相互比較卻沒有顯著性意義。 結(jié)論：DDT可以誘導(dǎo)大鼠大腦皮層、海馬和小腦的ROS含量升高，但是這種升高沒有觀察到劑量—反應(yīng)關(guān)系，且與整體實(shí)驗(yàn)當(dāng)中觀察到的臨床中毒并不一致，推測升高的ROS在發(fā)病機(jī)制中并不起決定作用，它可能更多地參與介導(dǎo)某些下游信號(hào)通路的運(yùn)行。 第三部分滴滴涕對(duì)體外培養(yǎng)PC12細(xì)胞的活性氧含量的影響及抗氧化劑tBHQ的拮抗作用 目的：以PC12細(xì)胞為體外實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?，觀察DD

11、T對(duì)PC12細(xì)胞ROS含量的影響以及tBHQ的拮抗效應(yīng)。 方法：40μmol/L的tBHQ采用預(yù)孵育16h的方式，熒光分光光度法測定低、高劑量的DDT(1×10-9和1×10-8mg/ml)單獨(dú)或者與tBHQ聯(lián)合給藥，在2h、6h、12h和24h對(duì)PC12細(xì)胞胞內(nèi)ROS含量的影響。 結(jié)果：在體外實(shí)驗(yàn)條件下，在各個(gè)時(shí)間組別中，DDT各個(gè)劑量組均可以誘導(dǎo)ROS含量升高，但劑量—反應(yīng)關(guān)系不是十分明顯；低劑量組ROS含量隨著時(shí)間

12、推延先下降，然后再升高；在高劑量組未觀察到時(shí)間—反應(yīng)關(guān)系；另外，單獨(dú)的給予tBHQ，并不影響細(xì)胞胞內(nèi)ROS的生成。在各個(gè)時(shí)間點(diǎn)，tBHQ+低劑量組與tBHQ+高劑量組的ROS含量均低于各自的劑量組。 結(jié)論：在體外條件下，DDT也可以誘導(dǎo)ROS含量的升高，與體內(nèi)實(shí)驗(yàn)結(jié)果基本一致，tBHQ在所給劑量條件下，可以有效地拮抗DDT的這種毒效應(yīng)。 第四部分滴滴涕對(duì)體外培養(yǎng)PC12細(xì)胞胞內(nèi)氧化與酶性抗氧化系統(tǒng)的影響以及抗氧化劑tBH

13、Q的干預(yù)作用 目的：以PC12細(xì)胞為研究對(duì)象，觀察DDT對(duì)PC12細(xì)胞氧化—抗氧化系統(tǒng)的影響以及tBHQ的拮抗效應(yīng)。 方法：40μmol/L的tBHQ采用預(yù)孵育16h的方式，分光光度法測定不同劑量的DDT(1×10-9和1×10-8mg/ml)單獨(dú)或者與tBHQ聯(lián)合給藥，在2h、6h、12h和24h對(duì)PC12細(xì)胞胞內(nèi)MDA含量、SOD、GSH-PX、GR和GST的活性影響；HpLC法測定同等條件下胞內(nèi)谷胱甘肽(gluta

14、thione，GSH)含量以及γ-谷氨酸-半胱氨酸連接酶(γ-glutamatecysteineligase，γ-GCS)的活性。 結(jié)果：在體外實(shí)驗(yàn)條件下，通過一定時(shí)間的預(yù)孵育，tBHQ在一定范圍內(nèi)可以明顯拮抗DDT誘導(dǎo)PC12細(xì)胞發(fā)生的氧化應(yīng)激；tBHQ對(duì)SOD活性影響不大或者根本無影響；tBHQ誘導(dǎo)的抗氧化酶當(dāng)中，以GR活性的升高出現(xiàn)得最快，先于Ⅱ相解毒酶GST和γ-GCS。 結(jié)論：tBHQ的拮抗作用與DDT的給藥劑