天然抗氧化劑抗氧化損傷作用及機(jī)制.pdf

1、自本世紀(jì)二十年代自由基學(xué)說創(chuàng)立以來，對于自由基損傷的研究就不斷深入。大量研究表明，有機(jī)體的多種疾病都與自由基對機(jī)體的氧化損傷有關(guān)，自由基對生命與健康的影響和重要性已毋庸置疑，因此尋找有效的抗氧化劑就顯得十分重要。目前，由于合成抗氧化劑如二丁基羥基甲苯（BHT）、丁基羥基茴香醚（BHA）等多數(shù)技術(shù)復(fù)雜，成本較高，且有較大的毒性甚至致癌作用，使人們對合成抗氧化劑產(chǎn)生疑慮和排斥心理，臨床應(yīng)用有較大的局限性，而天然抗氧化劑安全，低毒，符合新世紀(jì)

2、人們對健康的需求，因此，從資源豐富的天然藥物中尋找高效、低毒、價(jià)廉的抗氧化劑已成為該領(lǐng)域研究的一個(gè)重要方向，其抗氧化作用機(jī)制的研究，對進(jìn)一步天然抗氧化藥物的研究開發(fā)具有重要意義。 第一部分葡萄籽原花青素抗心肌細(xì)胞氧化損傷作用及機(jī)制 原花青素（Proanthocyanidins或Procyanidins，簡稱PC）是植物中廣泛存在的一大類多酚化合物的總稱。起初統(tǒng)歸于縮合鞣質(zhì)或黃烷醇類。隨著分離鑒定技術(shù)的提高和對此類物質(zhì)的深

3、入研究與深刻認(rèn)識(shí)，現(xiàn)已成為獨(dú)樹一幟的一大類物質(zhì)并稱之為原花青素。40多年來人們對從眾多不同植物中提取出的PC進(jìn)行了大量研究，作為PC的理想來源，葡萄籽原花青素提取物（Grape seed proanthocyanidins extract，GSP）得到了最為深入和廣泛的關(guān)注。GSP是由不同數(shù)量的兒茶素或表兒茶素聚合而成。最簡單的原花青素是兒茶素與表兒茶素形成的二聚體，此外還有三聚體、四聚體等直至十聚體。按聚合度的大小，通常將二～四聚體稱

4、為低聚體，將五聚體上的稱為高聚體。GSP以B型為主，二聚體中，因兩個(gè)單體的構(gòu)象或鍵合位置的不同，可有多種異構(gòu)體，已分離鑒定的8種結(jié)構(gòu)形式分別命名為B1～B8。GSP具有多種重要生物活性，成為近年研究的熱點(diǎn)。 心血管疾病是世界范圍內(nèi)導(dǎo)致人類死亡的一個(gè)主要病因。它包括其自身的一套病理現(xiàn)象，主要有動(dòng)脈硬化，高血壓，充血性心臟損傷，心肌病，冠心病，心肌肥大，心律不齊，心室纖維顫動(dòng)，心動(dòng)過速，心肌梗塞等。大量動(dòng)物實(shí)驗(yàn)以及人體實(shí)驗(yàn)表明氧化壓

5、力在心臟損傷的發(fā)病機(jī)理中發(fā)揮重要作用。當(dāng)自由基產(chǎn)生和細(xì)胞內(nèi)抗氧化防御的平衡被過多的自由基打破時(shí)，將會(huì)產(chǎn)生氧化壓力從而誘導(dǎo)細(xì)胞損傷。自由基和氧化壓力可以誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，主要是通過脂質(zhì)過氧化反應(yīng)以及形成脂質(zhì)過氧化氫物。自由基清除物和抗氧化劑對多種心血管疾病具有保護(hù)作用。 第一節(jié)葡萄籽原花青素通過誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)的抗氧化酶保護(hù)心肌細(xì)胞凋亡 大量研究表明葡萄籽提取物（Grape seed extract，GSE）對多種心臟疾病有保護(hù)作用

6、。GSE的心血管保護(hù)作用主要?dú)w功于其抗氧化的特性。一系列研究表明多酚是GSE抗氧化功能的主要成分。本研究探討從GSE中提取分離的兩種主要的多酚化合物（兒茶素和原花青素B4）能否增加心肌細(xì)胞內(nèi)的抗氧化酶，且這種增強(qiáng)的細(xì)胞內(nèi)抗氧化防御能否保護(hù)氧化心肌細(xì)胞損傷。 第二節(jié)葡萄籽原花青素對阿霉素誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞毒性的保護(hù)作用及機(jī)制 阿霉素是一種高效的抗癌藥，但其嚴(yán)重的心肌損傷的副作用限制了其臨床應(yīng)用。據(jù)報(bào)道表明GSE對阿霉素誘導(dǎo)的心

7、肌細(xì)胞毒性有保護(hù)作用。本研究探討從GSE中提取分離的兩種主要的多酚化合物（兒茶素和原花青素B4）對阿霉素誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞損傷的保護(hù)作用以及其相關(guān)機(jī)制。 第二部分冬凌草甲素對砷誘導(dǎo)的細(xì)胞毒性和細(xì)胞凋亡的保護(hù)作用及機(jī)制 砷（Arsenic，As）是環(huán)境中一種主要的污染物，它存在與泥土和礦石中最終進(jìn)入地下水系統(tǒng)，從而污染飲用水資源，含砷的地下水對人類的健康是一個(gè)巨大的威脅。天然化合物或合成化合物通過激活Nrf2途徑可以保護(hù)細(xì)胞有

8、毒性物質(zhì)或致癌物引起的損傷，用天然化合物或合成化合物來激活Nrf2依賴的適應(yīng)性應(yīng)答從而抵抗環(huán)境中的毒性是癌癥預(yù)防的一個(gè)重要策略。近期研究表明，激活Nrf2信號通路對砷誘導(dǎo)的細(xì)胞毒性有保護(hù)作用，應(yīng)用天然Nrf2激活劑對抗砷的毒性具有重要意義。 冬凌草甲素（Oridonin）是從唇形科香茶菜屬植物中分離出的一種貝殼杉烯二萜類天然化合物，主要植物來源有：香茶菜、顯脈葉香茶菜、毛葉香茶菜、道孚香茶菜、冬凌草、延命草等。目前關(guān)于冬凌草甲素

9、的研究主要集中在其抗腫瘤的作用，其抗癌活性被認(rèn)為主要是依賴其抑制腫瘤細(xì)胞增長，減少血管生成以及增加腫瘤細(xì)胞凋亡。本研究探討了冬凌草甲素對砷誘導(dǎo)的細(xì)胞毒性和凋亡的保護(hù)作用，我們證明了冬凌草甲素是個(gè)新的Nrf2激活劑并闡明了Nrf2途徑被激活的機(jī)制。進(jìn)一步，我們證明了用針對Nrf2的天然化合物作為一種治療手段的可行性，從而保護(hù)人類免于日常生活中的各種環(huán)境因素的傷害。 第一節(jié)冬凌草甲素保護(hù)由砷誘導(dǎo)的UROtsa細(xì)胞毒性和細(xì)胞凋亡

10、 為了明確冬凌草甲素對砷誘導(dǎo)的細(xì)胞毒性的保護(hù)作用，我們采用了UROtsa細(xì)胞（膀胱尿路上皮細(xì)胞）模型，該模型為研究砷毒性的經(jīng)典模型。 第二節(jié)冬凌草甲素是一個(gè)Nrf2轉(zhuǎn)錄因子激活劑 研究表明ARE-熒光素酶報(bào)告基因的活性與Nrf2的蛋白表達(dá)水平聯(lián)系緊密，因此檢測冬凌草甲素對ARE-熒光素酶報(bào)告基因的活性的影響，可以反應(yīng)其對Nrf2的作用。 第三節(jié)冬凌草甲素通過上調(diào)Nrf2蛋白水平激活A(yù)RE依賴的抗氧化應(yīng)答

11、 本章圍繞冬凌草甲素對Nrf2蛋白水平和對相關(guān)基因mRNA水平的作用取得了以下結(jié)果： 1．將雙熒光素酶實(shí)驗(yàn)的細(xì)胞裂解液用于Nrf2，Keap1 andβ-actin的免疫印跡檢測，結(jié)果表明，冬凌草甲素素可以劑量依賴性的提高Nrf2的蛋白水平，14μM時(shí)作用最強(qiáng)。 2．檢測高濃度冬凌草甲素作用是對Nrf2蛋白水平的影響，結(jié)果表明當(dāng)冬凌草甲素濃度高于28μM時(shí)劑量依賴性地降低Nrf2蛋白水平，且Keap1和β-actin的表

12、達(dá)沒有明顯變化。 3．用real time RT-PCR檢測了冬凌草甲素處理后Nrf2以及其下游基因NQO1和HO-1 mRNA的表達(dá)水平。結(jié)果表明Nrf2 mRNA水平有較弱的提高，呈劑量依賴關(guān)系。NQO1和HO-1的mRNA水平都有顯著的提高，且呈劑量關(guān)系。 第四節(jié)冬凌草甲素阻斷Nrf2泛素化并增強(qiáng)Keap1泛素化 tBHQ通過干擾keap-1依賴的泛素結(jié)合過程從而提高Nrf2蛋白水平，因此，我們也檢測了冬凌

13、草甲素調(diào)節(jié)Nrf2泛素化的能力，取得了以下結(jié)果： 1．冬凌草甲素抑制MDA-MB-231細(xì)胞和UROtsa細(xì)胞中Nrf2的泛素化。 2．冬凌草甲素增加MDA-MB-231細(xì)胞和UROtsa細(xì)胞中keap1的泛素化。 3．冬凌草甲素延長MDA-MB-231細(xì)胞中內(nèi)源性Nrf2蛋白的半衰期，從19分鐘到51分鐘；冬凌草甲素延長UROtsa細(xì)胞中內(nèi)源性Nrf2蛋白的半衰期，從10分鐘到16分鐘。 以上研究結(jié)果表