shRNA介導(dǎo)VEGFR-,2-基因沉默對(duì)白血病抑制作用的研究.pdf

1、對(duì)急性白血病的治療已取得很大進(jìn)展，國(guó)內(nèi)外對(duì)兒童急性白血病化學(xué)治療進(jìn)行了較多的臨床探索，化療方案幾經(jīng)改進(jìn)，但仍不盡人意。尋找高效低毒的選擇性抗癌藥物是白血病治療的必然趨勢(shì)。 在基因治療領(lǐng)域，RNA干擾(RNAinterference，RNAi)為病毒感染、腫瘤以及其它很多疾病的治療提供了新的治療思路，應(yīng)用前景極為廣闊。到目前為止較為常用的制備siRNA的方法有以下5種：(1)化學(xué)合成法(2)體外轉(zhuǎn)錄法(3)核糖核酸酶(ribonu

2、clease，RNase)Ⅲ家族體外消化法(4)siRNA表達(dá)載體法(5)siRNA表達(dá)框架法。后兩種方法是體內(nèi)表達(dá)，基于具有合適啟動(dòng)子的載體或轉(zhuǎn)導(dǎo)元件在哺乳動(dòng)物或細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄生成siRNA。其中siRNA表達(dá)載體法通過(guò)轉(zhuǎn)染含有RNaseⅢ啟動(dòng)子U6或H1及其下游一小段特殊結(jié)構(gòu)的質(zhì)?；虿《镜剿拗骷?xì)胞內(nèi)，轉(zhuǎn)錄出短發(fā)夾狀RNA(shorthairpinRNA，shRNA)，shRNA在胞內(nèi)被Dicer酶剪切成siRNA而發(fā)揮作用。優(yōu)點(diǎn)是轉(zhuǎn)錄篩

3、選后可穩(wěn)定表達(dá)，允許包括胚胎干細(xì)胞在內(nèi)的大范圍細(xì)胞系RNAi的持續(xù)作用；解決轉(zhuǎn)染效率低的問(wèn)題，無(wú)Rnase污染。缺點(diǎn)是不適于篩選有效siRNA序列。RNAi用于腫瘤基因治療存在下列問(wèn)題：(1)siRNA的轉(zhuǎn)染方法和效率：目前基因治療最大的限制因素就是核酸轉(zhuǎn)運(yùn)效率低下，在開(kāi)始臨床實(shí)驗(yàn)之前，需找到更合適的將siRNA轉(zhuǎn)染動(dòng)物體內(nèi)細(xì)胞的方法。(2)有效地把siRNA導(dǎo)入到體內(nèi)靶組織，維持其活性，是驗(yàn)證siRNA有效性及將來(lái)成功用于治療的關(guān)鍵。

4、生物載體中病毒載體導(dǎo)入在某些動(dòng)物模型上已被證實(shí)有效且持續(xù)時(shí)間長(zhǎng)，其中基于人類(lèi)免疫缺陷Ⅰ型病毒(humanimmunodeficiencyvirusⅠ，HIV-Ⅰ)的慢病毒載體具有可感染非分裂細(xì)胞、轉(zhuǎn)移基因片段容量較大、目的基因表達(dá)時(shí)間長(zhǎng)、不易誘發(fā)宿主免疫反應(yīng)等優(yōu)點(diǎn)，成為目前較有前途的病毒載體，且適于骨髓。 近年來(lái)的研究成果證實(shí)了腫瘤生長(zhǎng)依賴(lài)于血管生成，并發(fā)現(xiàn)血管生成也是腫瘤轉(zhuǎn)移所必需的，且至少部份地導(dǎo)致腫瘤多藥耐藥。研究結(jié)果表明

5、，多種血液系統(tǒng)腫瘤存在明顯的骨髓血管新生現(xiàn)象。腫瘤細(xì)胞分泌的多種血管生成因子之間相互聯(lián)系和調(diào)控，其中血管內(nèi)皮細(xì)胞生成因子(vascularendothelialgrowthfactor，VEGF)和血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子受體(vascularendothelialgrowthfactorreceptor，VEGFR)處于整個(gè)腫瘤血管生成過(guò)程的上游和中心。VEGFR2在VEGF的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)及血管內(nèi)皮生成、遷移、抑凋亡中起主導(dǎo)作用。以VEGF及

6、其受體作為相對(duì)特異性腫瘤血管生成標(biāo)志物，抑制其表達(dá)或阻斷其效應(yīng)是目前國(guó)外抗血管生成治療腫瘤的熱點(diǎn)，將為腫瘤的臨床治療探索一條新途徑。 近年，VEGF及VEGFR2與白血病的關(guān)系日益受到重視。首先VEGF以旁分泌的方式調(diào)節(jié)白血病的血管形成，即白血病細(xì)胞分泌的VEGF選擇性作用于血管內(nèi)皮細(xì)胞(endothelialcell，EC)上的特異性VEGFR2，并通過(guò)酪氨酸激酶介導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，不僅促進(jìn)產(chǎn)生新生血管，導(dǎo)致骨髓異常增殖，還對(duì)維持

7、腫瘤新生血管的生存起著重要作用。目前，越來(lái)越多的證據(jù)表明，白血病中存在VEGF/VEGFR2的自分泌機(jī)制，即白血病細(xì)胞分泌的VEGF誘導(dǎo)自身表達(dá)VEGFR2，從而維持自身存活、增殖，阻止腫瘤細(xì)胞凋亡，增強(qiáng)血液腫瘤細(xì)胞對(duì)放化療的抵抗作用，并引起細(xì)胞遷移。目前針對(duì)VEGF及其受體進(jìn)行抑制腫瘤的治療方法中有三方面受到重視：①抑制VEGF的小分子化合物；②針對(duì)受體的藥物設(shè)計(jì)；③酪氨酸激酶抑制劑。現(xiàn)已有VEGFR2單克隆抗體(monoclonal

8、antibody，McAb)應(yīng)用于臨床實(shí)驗(yàn)，但其靶點(diǎn)需經(jīng)過(guò)細(xì)胞表面呈遞來(lái)決定是否特異結(jié)合；而白血病病人免疫抑制，McAb作用完全性有可疑。反義寡核苷酸技術(shù)沒(méi)有放大效應(yīng)，用量較大，抑制基因表達(dá)效果為50％-90％，對(duì)一些受體核特殊蛋白的抑制作用僅10％-20％。而RNAi技術(shù)能快速、高效、特異地抑制靶基因表達(dá)，在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中一般使用濃度極低。由于RNAi有明顯放大作用，抑制靶向蛋白表達(dá)效果更加明顯，在疾病的基因治療上有廣闊的應(yīng)用前景。

9、 基于上述研究，本研究擬利用先進(jìn)的shRNARNAi技術(shù)，首先篩選出有效人VEGFR2siRNA，設(shè)計(jì)合成shRNA，將插入shRNA的表達(dá)載體與慢病毒包裝質(zhì)粒整合，體外作用于人EC株和表達(dá)VEGFR2的白血病細(xì)胞株HL60，觀(guān)察沉默效果；在此基礎(chǔ)上將shRNA用慢病毒載體導(dǎo)入NOD/SCID小鼠作全身白血病型抑瘤研究，探討VEGFR2shRNA是否阻斷白血病細(xì)胞的旁分泌途徑，抑制新生血管形成及是否作用于白血病細(xì)胞，影響VEGF自

10、分泌途徑，促進(jìn)白血病細(xì)胞凋亡。 第一章.VEGFR2siRNA的設(shè)計(jì)與篩選 RNAi現(xiàn)象能提供一種經(jīng)濟(jì)、快捷、高效的抑制基因表達(dá)的技術(shù)手段，對(duì)RNAi的不斷深入了解以及相應(yīng)試劑盒的問(wèn)世，為利用RNAi技術(shù)進(jìn)行各項(xiàng)研究奠定了基礎(chǔ)，將逐漸成為藥物靶點(diǎn)篩選和鑒定的強(qiáng)大工具，并可用于抗腫瘤等的基因治療。VEGFR2及其信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中的關(guān)鍵蛋白質(zhì)是抗白血病及抗血管生成療法的適宜靶點(diǎn)，可增加治療的特異性，提高療效，減少毒副作用。本實(shí)驗(yàn)擬

11、設(shè)計(jì)3對(duì)VEGFR2siRNA，化學(xué)合成后篩選出抑制HL60細(xì)胞VEGFR2表達(dá)效果最強(qiáng)的一對(duì)，并用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。 第二章.shRNA入門(mén)克隆對(duì)HL60及EC細(xì)胞VEGFR2的瞬時(shí)抑制 本研究擬根據(jù)篩選出的有效siRNA設(shè)計(jì)VEGFR2shRNA，利用siRNA表達(dá)載體法，構(gòu)建入門(mén)克隆pU6/shVEGFR2，瞬時(shí)轉(zhuǎn)染人EC和HL60細(xì)胞，觀(guān)察其對(duì)VEGFR2表達(dá)的干擾效果。 第三章.攜帶shRNA的慢病毒載體轉(zhuǎn)導(dǎo)

12、HL60細(xì)胞 用shRNA表達(dá)質(zhì)粒實(shí)施基因沉默的優(yōu)勢(shì)在于可以使質(zhì)粒序列整合到靶細(xì)胞的基因組上，實(shí)現(xiàn)shRNA的穩(wěn)定表達(dá)和對(duì)基因的持續(xù)抑制。所用載體影響到shRNA的轉(zhuǎn)導(dǎo)效率。本章的目的是應(yīng)用是以HIV-1為基礎(chǔ)發(fā)展起來(lái)的慢病毒載體將針對(duì)VEGFR2的shRNA表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)導(dǎo)HL60細(xì)胞，驗(yàn)證是否能高水平抑制其VEGFR2的表達(dá)。 第四章.慢病毒介導(dǎo)的shRNA對(duì)HL60模型鼠VEGF/VEGFR2旁分泌和自分泌的影響

13、 本實(shí)驗(yàn)前面的研究已建立以慢病毒為載體的Lenti6/shVEGFR2，可在體外抑制白血病細(xì)胞HL60和ECVEGFR2的表達(dá)。故本節(jié)試圖從直接殺死白血病細(xì)胞和抑制血管生成兩個(gè)方面研究動(dòng)物體內(nèi)白血病治療的新策略，在臨床治療中可能具有更大的意義。 結(jié)論 1.綜合現(xiàn)有設(shè)計(jì)siRNA原則，所設(shè)計(jì)的siRNA經(jīng)化學(xué)合成后抑制HL60細(xì)胞VEGFR2表達(dá)效果較強(qiáng)。 2.首次構(gòu)建入門(mén)克隆pU6/shVEGFR2。瞬時(shí)轉(zhuǎn)染H

14、L60和人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞株EA·hy926細(xì)胞，可抑制VEGFR2表達(dá)及HL60細(xì)胞生長(zhǎng)。 3.pU6/shVEGFR2入門(mén)克隆轉(zhuǎn)染HL60細(xì)胞后對(duì)細(xì)胞的抑制優(yōu)于siRNA。 4.使用含GateWayTM技術(shù)的pLenti6/V5-DESTTM載體，通過(guò)重組在入門(mén)和表達(dá)載體間可快速轉(zhuǎn)換shVEGFR2，首次構(gòu)建慢病毒攜帶的Lenti6/shVEGFR2表達(dá)克隆。 5.相比pU6/shVEGFR2入門(mén)克隆轉(zhuǎn)染，pL

15、enti6/shVEGFR2表達(dá)克隆轉(zhuǎn)導(dǎo)HL60細(xì)胞后持續(xù)高水平抑制細(xì)胞。 6.腫瘤細(xì)胞HL60對(duì)EC有骨髓趨化性，有助于白血病模型鼠的建立。 7.重組慢病毒Lenti6/shVEGFR2具有抑制白血病小鼠骨髓血管生成的作用；VEGFR2siRNA可阻斷白血病HL60細(xì)胞VEGF/VEGFR2自分泌的內(nèi)環(huán)路，在體外、動(dòng)物體內(nèi)均得到驗(yàn)證；VEGF/VEGFR2自分泌鏈和旁分泌鏈的聯(lián)合阻斷加強(qiáng)了抗白血病效果。VEGFR2RN