氨基甾體H42389對慢性髓性白血病細胞癌基因蛋白抑制作用的探討.pdf

1、目的:研究氨基甾體H42389對K562細胞系及CML細胞的增殖及分化作用，探討氨基甾體H42389對慢性髓性白血病細胞Ras癌基因相關(guān)蛋白的抑制作用。
　　方法:通過細胞培養(yǎng)實驗、集落培養(yǎng)實驗、MTT實驗觀察氨基甾體H42389對K562及CML細胞抑制增殖作用;采用Wright染色，聯(lián)苯胺染色，NBT染色和流式細胞術(shù)觀察K562和CML細胞功能變化，評價氨基甾體H42389對K562和CML細胞的誘導分化作用;通過熒光分光光度

2、計檢測氨基甾體H42389作用于K562和CML細胞30分鐘后胞內(nèi)游離鈣離子濃度的變化;通過Realtime-PCR檢測氨基甾體H42389對K562和CML細胞鈣通道蛋白mRNA表達的影響。
　　結(jié)果:
　　1.氨基甾體H42389對K562細胞和CML細胞增殖的影響。將氨基甾體H42389按設(shè)定濃度加入到K562和CML細胞中，經(jīng)5天孵育，可以觀察到:隨著藥物濃度的加大，細胞增殖抑制程度加重，細胞MTT的A492值有明顯

3、的下降趨勢。
　　2.H42389對K562細胞和CML細胞分化的影響。K562和CML細胞培養(yǎng)5d后，Wright染色，光鏡下經(jīng)氨基甾體H42389處理后的細胞與對照組比可見細胞體積變大，核漿比例減少，表現(xiàn)一定程度的分化。K562細胞內(nèi)血紅蛋白聯(lián)苯胺染色顯示，氨基甾體H42389作用5天后，聯(lián)苯胺染色的A492值隨著藥物濃度的升高而增高;CML細胞NBT染色A492值在一定藥物濃度(10-6mol/L～10-9mol/L)下呈現(xiàn)

4、出劑量依賴關(guān)系。流式細胞儀分析顯示，10-6mol/L的氨基甾體H42389作用于K562細胞4天后，細胞膜上CD71表面標記表達陽性率為79％;作用于CML細胞4天后，細胞膜上CD14表面標記表達陽性率為77％。
　　3.氨基甾體H42389抑制K562細胞和CML細胞的增殖和誘導其分化作用的機制研究
　　(1)氨基甾體H42389對K562和CML細胞內(nèi)游離[Ca2+]i的影響。10-6mol/L的H42389處理已用F

5、ura-2/AM負載過的K562和CML細胞，孵育后上機檢查結(jié)果顯示，K562細胞對照組的熒光值是176.30±1.62，處理組為114.88±1.73;CML細胞對照組的熒光值是184.03±1.52，處理組為112.90±0.91。表明經(jīng)藥物處理后的K562和CML細胞內(nèi)游離[Ca2+]i明顯低于對照組。
　　(2)Realtime-PCR檢測氨基甾體H42389作用后K562和CML細胞鈣通道蛋白mRNA的表達量變化。處理組

6、和對照組K56細胞鈣通道m(xù)RNA相對含量分別是2.45×10-3、5.59×10-3，結(jié)果說明H42389作用K562細胞后可明顯下調(diào)鈣通道m(xù)RNA;處理組和對照組CML細胞鈣通道m(xù)RNA相對含量分別是2.24×10-3、5.74×10-3，結(jié)果說明H42389作用CML細胞后可明顯下調(diào)鈣通道m(xù)RNA;
　　(3)Realtime-PCR檢測氨基甾體H42389作用后K562和CML細胞TC10 mRNA的表達量變化。處理組和對照

7、組K56細胞TC10 mRNA相對含量分別是2.17×10-2、6.65×10-2，結(jié)果說明H42389作用K562細胞后可明顯下調(diào)TC10mRNA;處理組和對照組CML細胞鈣通道m(xù)RNA相對含量分別是2.22×10-3、6.71×10-2，結(jié)果說明H42389作用CML細胞后可明顯下調(diào)TC10mRNA;
　　結(jié)論:
　　1.氨基甾體H42389能明顯抑制K562細胞以及CML細胞的生長增殖，在一定藥物濃度范圍內(nèi)呈現(xiàn)出濃度依

8、賴關(guān)系。
　　2.氨基甾體H42389能夠明顯誘導K562細胞向紅系分化成熟以及誘導CML細胞向單核巨噬系分化成熟。
　　3.氨基甾體H42389可使K562細胞以及CML細胞內(nèi)游離鈣含量顯著下降。
　　4.氨基甾體H42389具有促進有效下調(diào)K562細胞以及CML細胞鈣通道蛋白mRNA表達的能力。
　　5.氨基甾體H42389具有有效下調(diào)K562細胞以及CML細胞Ras癌基因相關(guān)蛋白TC10 mRNA表達的能力