缺血再灌注對心肌膠原網(wǎng)絡的影響及機制的研究.pdf

1、膠原纖維在心臟的分布廣泛，它們在心肌細胞之間相互編織，構(gòu)成一個多層次、多方位復雜的三維空間網(wǎng)絡，其可以保證比鄰心肌的結(jié)構(gòu)完整，提供由心肌收縮轉(zhuǎn)化成心室泵功能的工作方式，并且是維持肌原纖維成線形排列所必須。缺血再灌注是一個復雜的病理生理過程。心肌缺血再灌注損傷后，心臟內(nèi)存在的腎素-血管緊張素-醛固酮(RAA)系統(tǒng)明顯上調(diào)，血管緊張素Ⅱ(AngⅡ)表達增加、炎性細胞因子和氧自由基大量釋放，激活基質(zhì)金屬蛋白酶，這必將引起心肌膠原網(wǎng)絡的破壞，本

2、研究旨在探討心肌缺血再灌注后膠原網(wǎng)絡的變化，并初步探討其機制和保護措施。 第一部分動物模型的建立 實驗一鼠心肌在體缺血再灌注模型的建立 目的:探討大鼠在體心肌缺血再灌注模型的建立及改進方法。 方法:采用成年SD大鼠50只，隨機分為假手術(shù)組和實驗組，動物麻醉后，氣管插管，經(jīng)左側(cè)第四肋間進胸，不剪斷肋骨，左冠狀動脈前降支采用縮帶阻斷，阻斷后即可關胸，在胸外松開縮帶即恢復再灌注，避免了二次開胸。大大減少了造模時

3、間，降低了死亡率，造模成功率高。用心電圖J點抬高與高聳T融合呈弓背向上的單相曲線和肉眼觀察及病理檢查作為判斷結(jié)扎成功指標，檢測心肌梗死面積(MIS)、心肌含水量(MWC)、心肌酶變化(LDH、CK)。 結(jié)果:改進的造模方法的25只，成功18只。成功率72％。 結(jié)論:本方法操作簡單、方便，造模成功率高。 實驗二大鼠缺血再灌注心肌頓抑模型的建立 目的:探討建立在體心肌缺血再灌注頓抑模型的手術(shù)方法。

4、 方法:采用成年SD大鼠20只，隨機分為實驗組和假手術(shù)組。經(jīng)左側(cè)第四肋間進胸，左冠狀動脈前降支縫制縮帶后即關胸，勒緊縮帶阻斷前降支，心肌缺血5min，在胸外松開縮帶恢復再灌注10min，重復12次后，再灌注60min建立心肌缺血頓抑模型。術(shù)中監(jiān)測心電圖，經(jīng)右頸總動脈插入PE50導管至左心室，監(jiān)測心臟功能指標。術(shù)終留取心肌標本做病理檢查。 結(jié)果:實驗組10只有8只存活，1只死于出血，1只死于心律失常。阻斷左冠狀動脈的前降支后

5、，心電圖出現(xiàn)異常，表現(xiàn)為S-T段延長，T波倒置。頓抑組心臟功能降低。而光鏡下心肌組織結(jié)構(gòu)正常。 結(jié)論：該模型符合心肌頓抑的特點；該方法操作簡單，結(jié)果可靠，可重復性強，是一種建立在體大鼠缺血再灌注心肌頓抑模型的可靠方法。 第二部分缺血再灌注及頓抑對鼠心肌膠原網(wǎng)絡及心功能影響的研究 實驗一大鼠心肌缺血再灌注后膠原纖維網(wǎng)絡變化的研究 目的:探討缺血再灌注對大鼠心臟膠原纖維網(wǎng)絡的影響。 方法:成年

6、SD大鼠20只，分對照組和缺血再灌注組。阻斷左冠狀動脈前降支60min，再灌注60min，制備缺血再灌注組實驗動物模型，留取心肌組織檢測心肌羥脯氨酸含量，組織切片做Masson染色。 結(jié)果:缺血再灌注組心肌羥脯氨酸含量顯著低于對照組。Masson染色結(jié)果顯示對照組每個心肌細胞均有一層膠原鞘，心肌細胞群之間有粗大的膠原纖維膜相間隔，所有的膠原纖維彼此連續(xù)成網(wǎng)。而缺血再灌注組粗、細膠原纖維明顯斷裂、消失，膠原網(wǎng)絡解體，心肌細胞之間的

7、空隙加大。 結(jié)論心肌缺血再灌注可使膠原纖維降解，膠原纖維的網(wǎng)絡的破壞。 實驗二大鼠頓抑心肌的膠原變化及其與心功能關系的研究 目的：探討鼠心肌頓抑對膠原網(wǎng)絡的影響及其與心功能的關系。 方法：采用成年SD大鼠20只，隨機分為實驗組和假手術(shù)組。建立缺血再灌注心肌頓抑模型。術(shù)中監(jiān)測體動脈壓、左室心功能指標。留標本做心肌各層羥脯氨酸含量，病理切片HE染色。 結(jié)果：實驗組主動脈壓無明顯變化，而左室收

8、縮壓(LVSP)、舒張末壓(LVEDP)、及壓力最大變化速率(±dp.dtmax)均較對照組明顯降低。心肌羥脯氨酸含量也顯著減少，其中心肌內(nèi)膜較對照組無明顯變化，而中層和外膜較對照組分別下降12.5％和14.6％。 結(jié)論：頓抑心肌的膠原明顯降解，心肌的收縮及舒張功能下降。提示心肌的膠原降解可能是心肌頓抑后心功能下降的原因。 第三部分缺血再灌注對鼠心肌膠原網(wǎng)絡影響的機制及其保護的研究 實驗一基質(zhì)金屬蛋白酶-2對離體

9、鼠心肌缺血再灌注間質(zhì)損傷的影響 目的:探討基質(zhì)金屬蛋白酶-2(MMP-2)在鼠缺血再灌注心肌的表達，及其與心肌間質(zhì)損傷和心功能變化的關系。 方法:Sprague-Dawley(SD)大鼠24只，隨機分為對照組、缺血再灌注組和強力霉素組，每組8只。分別建立改良的Langendorrf離體心灌注模型，測定左室收縮峰壓及壓力微分，氯胺T法測定膠原含量，免疫組化法測定Ⅰ/Ⅲ膠原比例，酶譜法測定冠脈回流液不同時間點的MMP-2及其

10、酶原(pro-MMP-2)。Westernblot檢測心肌MMP-2的表達。 結(jié)果:MMP-2活性在心肌缺血再灌注早期即明顯升高，且其活性與心功能的恢復呈明顯的相關性。心肌膠原含量和Ⅰ/Ⅲ比值較對照組均明顯下降。強力霉素組表現(xiàn)出明顯的保護作用。 結(jié)論:MMP-2在心肌缺血再灌注間質(zhì)損傷中起關鍵作用，應用MMP-2抑制劑可能成為保護心肌缺血再灌注損傷的新的方法。 實驗二強力霉素對心肌間質(zhì)缺血再灌注損傷影響

11、的研究 目的：探討不同濃度的強力霉素對離體鼠心缺血再灌注心肌間質(zhì)損傷的影響。 方法：Sprague-Dawley(SD)大鼠40只，隨機分為對照組、缺血再灌注組和強力霉素1、2、3組，每組8只。分別建立改良的Langendorrf離體心灌注模型，測定左室收縮峰壓及其壓力微分，氯胺T法測定心肌膠原含量，免疫組化法測定Ⅰ/Ⅲ膠原比例，酶譜法檢測心肌MMP-2的表達。 結(jié)果：較高濃度強力霉素的對基質(zhì)金屬蛋白酶-2(MM

12、P-2)的抑制作用更強，離體心缺血再灌注后心肌膠原降解程度隨MMP-2活性下降而減少，心功能改善。 結(jié)論：強力霉素對離體鼠心缺血再灌注后心肌間質(zhì)損傷有與濃度相關的保護作用。 實驗三MMP抑制劑對鼠心肌缺血再灌注心肌間質(zhì)重塑的影響 目的:研究大鼠心肌缺血再灌注后MMP抑制劑強力霉素在心肌間質(zhì)重塑中的作用。 方法:70只SD大鼠隨機分為對照組(假手術(shù)組)、心肌缺血再灌注后1d組、心肌缺血再灌注后1w

13、組、心肌缺血再灌注后2w組、心肌缺血再灌注后4w組、強力霉素治療2w組、和強力霉素治療4w組，每組10只。檢測心功能指標，采用免疫組化檢測心肌Ⅰ、Ⅲ型膠原蛋白表達，測定心肌羥脯氨酸含量，酶譜法檢測基質(zhì)金屬蛋白酶2、9活性，逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(RT-PCR)檢測MMP2、9mRNA的表達。 結(jié)果:強力霉素治療組與非治療組比較，缺血再灌注心肌膠原含量明顯減少，Ⅰ/Ⅲ型膠原比值下降得以改善，MMP2、9活性及mRNA表達減少，治療組

14、心功能改善。 結(jié)論:強力霉素可能通過抑制MMP2、9的活性和表達，阻止心肌缺血再灌注損傷遠期間質(zhì)膠原的沉積和纖維化。 實驗四TGF-β1對缺血再灌注頓抑心肌間質(zhì)損傷影響的研究 目的：探討TGF-β1對心肌頓抑后心肌間質(zhì)損傷的影響和機制。 方法：Sprague-Dawley(SD)大鼠30只，隨機分為對照組、頓抑組和TGF-β1組，每組10只。建立頓抑心肌模型，測定各組心功能指標，酶譜法測定心肌M

15、MP2、9活性，RT-PCR檢測MMP2、9的mRNA的表達。留取心肌組織測定心肌膠原含量，HE染色病理檢查。 結(jié)果：TGF-β1組的MMP2、9活性和基因表達較I/R組明顯降低，心肌膠原含量提高，心功能明顯改善。 結(jié)論：TGF-β1通過抑制頓抑心肌的MMP2、9的表達和激活，保護心肌間質(zhì)，從而促進心功能恢復。 實驗五缺血再灌注心肌炎性細胞因子的表達對心肌間質(zhì)的影響 目的:探討炎性細胞因子的釋放

16、對心肌缺血再灌注后心肌間質(zhì)重塑的影響。 方法:30只SD大鼠隨機分為對照組(假手術(shù)組)、心肌缺血再灌注組、氯沙坦治療組。每組10只。采用免疫組化檢測心肌TNF-a、IL-1、IL-6和MMP-2、9的表達，組織切片做Masson染色。 結(jié)果:缺血再灌注心肌的TNF-a、IL-1、IL-6高表達，心肌組織Masson染色顯示，膠原明顯降解。氯沙坦治療組TNF-a、IL-1、IL-6的表達明顯下降，膠原降解減少。 結(jié)