RNAi沉默G-,α13-表達及其對人卵巢癌HO-8910PM細胞生長與轉(zhuǎn)移相關(guān)能力影響的研究.pdf

1、y926309I礬Ai沉默G棚表達及其對人卵巢癌HO8910PM細胞生長與轉(zhuǎn)移相關(guān)能力影響的研究RNAinterferencesilencesGalpha13expressionandstudiesontheaffectsgrowthandmetastasisassociatedabilityofhumanovariancarcinomaH08910PMcells學科門類醫(yī)學學科、專業(yè)生物化學與分子生物學研究方向年級研究生姓名導師姓名起

2、止日期基因治療與信息傳導二零零叁級曾振飛梁念慈教授劉新光教授20039—20066廣東醫(yī)學院生物化學教研室二OO六年五月RNAi沉默GⅢ表達及其對人卵巢癌HO8910PM細胞生長與轉(zhuǎn)移相關(guān)能力影響的研究摘要【目的】以RNA干擾(RNAi)㈣G。lj基因的表達觀察其對人卵巢癌HO8910PM細胞生長與轉(zhuǎn)移相關(guān)能力的影響，探索其作用機制為腫瘤治療提供新的策略。【方j(luò)；去】根據(jù)人GⅡ13基因序列及二級結(jié)構(gòu)特征，依據(jù)Tuschl等設(shè)計shRNA

3、的原則，確定Gb3干擾位點以ShuttleVector10CMV為載體，以定向克隆的方法構(gòu)建針對G。13的shRNA重組表達質(zhì)粒：電泳法初步篩選正確的重組克??；DNA測序驗證重組克隆的正確性；重組質(zhì)粒與綠色熒光表達蛋白表達質(zhì)粒pEGFPN1共轉(zhuǎn)染人卵巢癌細胞HO8910PM，熒光顯微鏡觀察轉(zhuǎn)染效果；RTPCR檢測在mRNA水平對Gm表達的影響：Westernblot檢測在蛋白水平對G。13表達的影響。MTT法檢測G。13沉默后對人卵巢癌

4、HO8910PM細胞的增殖影響；流式細胞術(shù)檢測G。13沉默后對人卵巢癌HO8910PM細胞周期的影響及凋亡情況：Tmnswellchamber法檢測Gm沉默后對人卵巢癌HO8910PM細胞侵襲能力和趨化性運動能力的影響；細胞基質(zhì)粘附實驗檢測G。13沉默后對人卵巢癌HO8910PM細胞粘附能力的影響；細胞骨架抽提術(shù)觀察G。13沉默后對細胞骨架的影響：放射自顯影法檢測GⅢ沉默后對Rho活性的影響?！窘Y(jié)果】成功構(gòu)建了針對人G?！?四個不同位點

5、的shRNA表達質(zhì)粒，能夠正常測序，并且測序結(jié)果證實了插入的轉(zhuǎn)錄模板完全正確；脂質(zhì)體介導下重組shRNA表達質(zhì)粒的轉(zhuǎn)染效率比較高：與未處理組比較，RNAi可使GⅢ的mRNA和蛋白水平均明顯下調(diào)，其中針對B位點的RNAi作用效果最明顯；RNAi沉默G。13表達后對人卵巢癌HO8910PM細胞的增殖、侵襲與運動都具有一定程度的抑制作用，對細胞的粘附能力無明顯影響：RNAi作用后，阻斷細胞于S期，無凋亡峰；RNAi沉默Gnl3表達后能改變細胞