人β防御素3的重組表達和在感染根管治療中抑菌作用的初步實驗研究.pdf

1、牙髓、根尖周炎癥是口腔內(nèi)科常見病，細(xì)菌則是牙髓、根尖周病的主要致病因素。根管治療術(shù)是通過根管預(yù)備、根管消毒和根管充填等步驟，殺滅感染細(xì)菌，消除來自根管的刺激源，利用根尖周組織血運豐富、修復(fù)再生能力強的特點，治療牙髓壞死或根尖周病的方法。其目標(biāo)是從根管開口到縮窄的根尖孔對整個根管進行三維清潔、成形和封閉，以達到治愈患牙，保存并恢復(fù)其功能的作用。而根管系統(tǒng)本身結(jié)構(gòu)復(fù)雜且與根尖周、牙周相通，雖然經(jīng)過機械和化學(xué)預(yù)備后，根管內(nèi)的細(xì)菌、壞死牙髓和根

2、管內(nèi)壁的感染物，大部分已被清除，但是對于側(cè)壁牙本質(zhì)小管深部，側(cè)支根管和根尖周等，器械以及沖洗液不易到達的地方仍存在細(xì)菌、毒素等病原刺激物，所以根管清理后的滅菌消毒仍是不容忽視的。長期的臨床追蹤觀察和基礎(chǔ)研究形成了很多不同的根管消毒方法和消毒藥物，目前學(xué)者們正在試圖尋找一種較理想的根管消毒藥物。
　　β防御素-3作為一種內(nèi)源性抗菌肽，其快速、高效、廣譜的抗菌效能和較少產(chǎn)生耐藥性的特點，使得其在口腔醫(yī)學(xué)中的研究和應(yīng)用有著較大的發(fā)展空間

3、和良好的發(fā)展前景，將其引入感染根管的治療領(lǐng)域，對根管內(nèi)的致病菌產(chǎn)生殺菌作用，將有可能大大提高和改善根管內(nèi)滅菌消毒的效果，達到治愈牙髓、根尖周病變的目的。本課題本著基礎(chǔ)研究與臨床應(yīng)用并重的目的而展開，通過基因工程技術(shù)來獲得有活性的重組人防御素-3，并分析其抗菌能力，經(jīng)過感染根管的體外和動物體內(nèi)實驗進一步研究rhBD-3在感染根管治療中的作用，以期為牙髓和根尖周感染，尤其是根管內(nèi)的重度感染的治療尋找一條新的途徑。
　　所進行的研究及結(jié)

4、果如下：
　　第一部分hBD3基因的克隆和序列測定
　　本研究根據(jù)在GenBank中登錄的hBD3的完整的cDNA序列，設(shè)計一對引物，以臨床獲取的正常人新鮮牙齦組織的mRNA為模板，采用RT-PCR的方法獲得了hBD3成熟肽編碼區(qū)全長序列，將其克隆入pGEM-T-EASY載體，在大腸桿菌中進行擴增，并進行了序列測定。結(jié)果表明，我們所獲得的序列與Harder等文獻報道的序列完全一致，未發(fā)現(xiàn)有堿基的缺失或突變。
　　第二部

5、分hBD3在大腸桿菌中的表達、純化及其表達產(chǎn)物的活性檢測
　　將hBD3成熟肽基因成功地正向克隆入pET-32a載體，構(gòu)建融合表達載體。將含有pET-32a-hBD3重組質(zhì)粒的BL21菌株經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后，表達產(chǎn)物經(jīng)SDS-PAGE顯示在約24KD處看到預(yù)期的條帶。Westernblot結(jié)果也提示HIS融合蛋白有基礎(chǔ)性表達。對不同誘導(dǎo)時間、溫度、IPTG濃度時融合蛋白表達率分析的結(jié)果表明：hBD3在35℃、0.6mmol/LIPT

6、G、誘導(dǎo)6小時表達量分別達高峰。表達的融合蛋白大部分以包涵體形式存在于沉淀中，小部分以可溶性形式存在于上清中。包涵體溶解物過Ni-NTA柱親和層析純化，經(jīng)洗脫液洗脫收集得到目的蛋白，然后經(jīng)多步透析法復(fù)性后，再進行離子交換層析和凝膠柱脫鹽、濃縮。以SDS-PAGE檢測，純化蛋白為單一條帶。腸激酶可以對融合蛋白進行切割，rhBD3從融合蛋白形式中分離出來，大小約5.1KD，與理論值接近。
　　rhBD3的生物學(xué)活性分析實驗顯示rhBD

7、3融合蛋白和融合蛋白酶切后的rhBD3成熟肽對于金黃色葡萄球菌和大腸桿菌都有明顯抑菌環(huán)出現(xiàn)，表示均有抗菌活性。
　　第三部分重組hBD3對感染根管致病菌抗菌活性的體外研究
　　重組hBD3對感染根管各種致病菌的抗菌活性檢測結(jié)果顯示，rhBD3對所有試驗菌株均有抑制和殺滅作用，隨著rhBD3的濃度增加，細(xì)菌數(shù)量減少，與天然提取的hBD3活性基本一致。但是MIC或MBC濃度對不同的細(xì)菌而言并不一致。rhBD3除了對常見兼性厭氧的

8、金黃色葡萄球菌，大腸桿菌有作用以外，對根管內(nèi)常見的專性厭氧菌的三種標(biāo)準(zhǔn)株有較好的抑制作用，而且對內(nèi)氏放線菌、白色念珠菌、糞腸球菌也有作用，對變形鏈球菌的抑制作用則比較小。
　　從重組hBD3對離體人牙根管內(nèi)致病菌抗菌活性研究的結(jié)果分析可以看出，封藥后細(xì)菌陽性的根管數(shù)量明顯低于封藥前，其差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.005），說明四種消毒藥物包括rhBD3對根管內(nèi)的優(yōu)勢致病菌均有抗菌或抑菌作用；對比四種消毒藥物對各種細(xì)菌的抗菌活性發(fā)現(xiàn)

9、，其中FC組、碘仿糊劑組和rhBD3組的抗菌活性高于Ca(OH)2糊劑組（P<0.05），特別是對于厭氧菌；但是FC組、碘仿糊劑組和rhBD3組間的抗菌活性則無明顯區(qū)別（P>0.05）。
　　第四部分重組hBD3對犬的感染根管內(nèi)致病菌抗菌活性的體內(nèi)研究
　　本實驗建立了犬的感染根管動物模型，攝X線片證實各實驗犬牙出現(xiàn)不同程度的牙周膜腔增寬、根尖周骨質(zhì)稀疏區(qū)。實驗中各處理組在根管封藥后，無論厭氧還是需氧菌，細(xì)菌的檢出率明顯減少

10、，經(jīng)x2檢驗,消毒前、后差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.005）。進一步兩兩比較，F(xiàn)c組，Ca(OH)2糊劑組，rhBD3組均與空白對照組有顯著差別（P＜0.05），前三者的細(xì)菌檢出數(shù)值遠(yuǎn)小于后者，說明Fc，Ca(OH)2糊劑，rhBD3對根管內(nèi)的需氧和厭氧菌均有抑制作用，都能顯著減少預(yù)備后根管內(nèi)的細(xì)菌。以上結(jié)果證實了rhBD3在感染根管內(nèi)的抑菌效果。另外Fc組、rhBD3組與Ca(OH)2糊劑組也有顯著性差別（P＜0.05），從數(shù)值上看，前

11、兩者的效果好于后者。經(jīng)x2檢驗,，rhBD3組對需氧和厭氧菌消毒前后的差異均具有極顯著性（P＜0.005），說明消毒效果都非常好，而對需氧和厭氧菌2個菌種之間的消毒差異無顯著性（P＞0.05）。
　　切片觀察封藥后各組實驗牙根尖周組織炎癥分級情況，空白對照組與3個藥物處理組有統(tǒng)計學(xué)差別（P＜0.05），說明每個藥物處理組對根尖周炎癥均有一定影響。Fc組與Ca(OH)2糊劑組相比有顯著性差別（P<0.05），從結(jié)果來看，F(xiàn)c組的根尖

12、周組織炎癥程度重于Ca(OH)2糊劑組，提示Fc組對根尖周炎癥的作用不理想，這可能與其本身的強刺激性有關(guān)。而rhBD3組與Ca(OH)2糊劑組相比也有顯著性差別，這或許與β-防御素具有間接的免疫激活作用有關(guān)。
　　綜上所述，根管系統(tǒng)的復(fù)雜性和感染細(xì)菌的多樣性，決定了根管滅菌消毒的必要性。根管預(yù)備完成后，在根管內(nèi)封入適當(dāng)?shù)乃幬?，可以進一步控制微生物，防止再感染，從而鞏固和加強根管預(yù)備的效果。根據(jù)以往對β防御素的研究結(jié)果結(jié)合以上我們的