吸煙誘導(dǎo)水解酶活性微囊泡在粥樣斑塊薄壁纖維帽進(jìn)展中的研究.pdf

1、目的:
　　 吸煙明顯增加動脈粥樣硬化（Atherosclerosis， AS）斑塊的破裂和破裂后血管內(nèi)血栓形成的危險性，然而相關(guān)分子機制尚不明確。微囊泡(Microvesciles，MVs)是細(xì)胞凋亡過程中產(chǎn)生的膜性囊狀結(jié)構(gòu)，近年研究證實動脈粥樣斑塊中存在大量單核巨噬細(xì)胞源性MVs，其致病力較母細(xì)胞更強、更持久，與AS斑塊的進(jìn)展密切相關(guān)。我們前期研究發(fā)現(xiàn)，TSE（Tobacco smoke extract，TSE）可增加單核細(xì)

2、胞源性MVs的產(chǎn)生，該MVs攜帶組織因子，體外具有強大的促凝活性，解釋了吸煙患者血液的高凝狀態(tài)和斑塊破裂后血栓形成的機制，但尚不能夠解釋吸煙患者AS斑塊破裂的機制。因此，本研究旨在探討TSE誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞源性MVs是否具有蛋白水解酶活性，并探討TSE誘導(dǎo)的蛋白水解酶活性MVs的分子性質(zhì)和產(chǎn)生的分子信號通路機制。
　　 方法:
　　 1.PMA誘導(dǎo)人THP-1單核細(xì)胞建立巨噬細(xì)胞模型和貼壁篩選法分離誘導(dǎo)外周血單核巨噬細(xì)胞;<

3、br>　　 2.酶譜法和熒光底物分解法測量TSE誘導(dǎo)MVs水解酶活性;
　　 3.在37℃應(yīng)用Pro-MMP2與分離MVs體外共孵育1h，然后用酶譜法檢測TSE誘導(dǎo)MVs激活Pro-MMP2的活性;
　　 4.免疫熒雙染色共聚焦顯微鏡觀察TSE誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞膜性基質(zhì)金屬蛋白酶1(membrane type1 metalloproteinase，MT1-MMP)又稱MMP14和細(xì)胞凋亡早期標(biāo)志物磷脂酰絲氨酸(PS)表達(dá)及分

4、布;
　　 5.Western Blot檢測TSE誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞MMP14蛋白表達(dá)變化、MAPKs信號通路的激活和MVs攜帶MMP14情況;
　　 6.應(yīng)用流式細(xì)胞技術(shù)測量TSE誘導(dǎo)總MVs和MMP14+MVs數(shù)量;
　　 7.應(yīng)用凋亡抑制劑(caspase inhibitor，CASPi)，觀察TSE誘導(dǎo)MMP14+MVs的產(chǎn)生和活性;
　　 8.應(yīng)用MAPKs信號通路p38/ERK/JNK特異性抑制劑干

5、預(yù)細(xì)胞后，觀察TSE誘導(dǎo)MVs產(chǎn)生和活性。
　　 結(jié)果:
　　 1.成功應(yīng)用PMA建立THP-1巨噬細(xì)胞和貼壁篩選法分離誘導(dǎo)人外周血原代單核巨噬細(xì)胞;
　　 2.TSE誘導(dǎo)MVs可動態(tài)水解人工合成熒光底物肽段1和降解凝膠中天然底物明膠蛋白和膠原蛋白;
　　 3.TSE誘導(dǎo)MVs可激活人工重組Pro-MMP2的活性，級聯(lián)放大效應(yīng)發(fā)揮水解膠原蛋白的活性;
　　 4.TSE誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞呈濃度和時間依賴性

6、增加MMP14的表達(dá)，共聚焦顯微鏡顯示MMP14在巨噬細(xì)胞膜上呈結(jié)節(jié)性表達(dá)增加且與細(xì)胞膜的早期凋亡標(biāo)志分子PS共定位，提示TSE誘導(dǎo)MVs攜帶MMP14;
　　 5.流式分析顯示TSE可誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞源性總MVs和MMP14+MVs的產(chǎn)生;
　　 6.CASPi可明顯抑制TSE誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞源性總MVs和MMP14+MVs的產(chǎn)生，并抑制MVs水解酶活性，不影響巨噬細(xì)胞表達(dá)MMP14;
　　 7.TSE可激活MAPKs

7、信號通路，使通路重要蛋白p38、ERK和JNK磷酸化，其中p38和JNK磷酸化與TSE誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞表達(dá)MMP14有關(guān)，與ERK的磷酸化無關(guān);
　　 8.應(yīng)用p38和JNK特異性抑制劑可明顯減少TSE誘導(dǎo)的MMP14+MVs的數(shù)量和活性。
　　 結(jié)論:
　　 TSE干預(yù)巨噬細(xì)胞可明顯增加蛋白水解酶活性MVs產(chǎn)生，與其攜帶的跨膜蛋白酶基質(zhì)金屬蛋白酶家族的MMP14有關(guān)，具有強大膠原和明膠蛋白酶的活性;TSE誘導(dǎo)的水