TROP2在非小細(xì)胞肺癌中的表達(dá)及其意義.pdf

1、第一部分TROP2在非小細(xì)胞肺癌中的表達(dá)及其與CD133的相關(guān)性
　　目的：檢測人滋養(yǎng)層細(xì)胞表面抗原-2（TROP2）在非小細(xì)胞肺癌（NSCLC）組織和細(xì)胞系中的表達(dá)，分析其與臨床病理因素和預(yù)后的關(guān)系，同時探討其與腫瘤干細(xì)胞標(biāo)志物CD133的關(guān)系。
　　方法：用流式細(xì)胞術(shù)檢測5株NSCLC細(xì)胞系、1株永生化正常人支氣管上皮細(xì)胞系中TROP2的表達(dá)，RT-PCR檢測22例術(shù)后NSCLC腫瘤組織及其癌旁組織，免疫組化檢測98例N

2、SCLC術(shù)后組織中TROP2和CD133的表達(dá)，并結(jié)合臨床病理因素及預(yù)后進(jìn)行分析，以免疫熒光法和激光共聚焦顯微鏡觀察其定位和共定位。
　　結(jié)果：5株NSCLC細(xì)胞系中H1975、SPCA-1、PC-9有TROP2表達(dá)，A549、H1299及正常人支氣管上皮細(xì)胞系HBE中無表達(dá)。TROP2 mRNA的表達(dá)陽性率為68.2%（15/22）。免疫組化顯示TROP2、CD133蛋白在NSCLC組織中的陽性表達(dá)率分別為42.86%（42/9

3、8）和29.59%（29/98），均明顯高于癌周正常肺組織及肺良性病變組織（P<0.01）；二者均表現(xiàn)為細(xì)胞分化程度越低表達(dá)陽性率越高，CD133達(dá)到統(tǒng)計學(xué)差異（P=0.02），TROP2未達(dá)到統(tǒng)計學(xué)差異（P=0.11）；TROP2、CD133的陽性表達(dá)率在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組顯著高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組（P=0.02,P=0.03），TROP2、CD133的陽性表達(dá)率隨著TNM分期的升高而升高（P=0.045,P=0.045）。TROP2、CD13

4、3在NSCLC中的表達(dá)具有密切相關(guān)性（P=1.87E-05），且兩種蛋白有共定位現(xiàn)象。TROP2與NSCLC患者術(shù)后生存期呈負(fù)相關(guān)趨勢，但差異未達(dá)到統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.076）。
　　結(jié)論：TROP2在NSCLC組織和細(xì)胞系中均有較高表達(dá)，并與腫瘤干細(xì)胞標(biāo)記物CD133存在共定位關(guān)系，TROP2可能在NSCLC的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用。
　　第二部分靶向TROP2的小干擾RNA慢病毒載體的構(gòu)建與包裝
　　目的：構(gòu)建并制

5、備攜帶靶向TROP2基因shRNA的高滴度慢病毒載體。
　　方法：根據(jù)TROP2基因序列設(shè)計4條siRNA作為干擾靶點，分別構(gòu)建4個shRNA慢病毒（Lentivirus, LV）表達(dá)載體并通過篩選選擇一條干擾率最高的序列，用含有此序列的GV248載體（hU6-MCS-Ubiquitin-EGFP-IRES-puromycin）及二種輔助包裝質(zhì)粒pHelper1.0載體、pHelper2.0載體共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，進(jìn)行病毒包裝成L

6、V-TROP2-shRNA，并進(jìn)行滴度測定。
　　結(jié)果：靶向TROP2的shRNA片段成功包裝入慢病毒載體，病毒滴度為1E+9TU/ml，達(dá)到進(jìn)一步實驗要求。
　　結(jié)論：成功制備了LV-TROP2-shRNA的高滴度慢病毒載體。
　　第三部分RNA干擾抑制TROP2表達(dá)對NSCLC生物學(xué)行為影響的體外研究
　　目的：LV-TROP2-shRNA載體轉(zhuǎn)染NSCLC細(xì)胞系PC-9，并進(jìn)行內(nèi)源驗證，進(jìn)一步觀察LV-TR

7、OP2-shRNA對PC-9細(xì)胞的體外作用。
　　方法：LV-TROP2-shRNA慢病毒載體轉(zhuǎn)染 PC-9細(xì)胞，流式細(xì)胞儀（FCM）檢測轉(zhuǎn)染效率，Real-time PCR檢測TROP2的基因敲減情況。實驗分三組：PC-9組(未感染任何病毒的正常目的細(xì)胞PC-9)，PC-9/Con組(空載體病毒轉(zhuǎn)染組)，PC-9/shRNA組(轉(zhuǎn)染LV-TROP2-shRNA)。CCK-8比色法檢測細(xì)胞增殖能力，劃痕實驗檢測細(xì)胞遷移能力，Tra

8、nswell侵襲實驗檢測細(xì)胞侵襲能力。
　　結(jié)果：LV-TROP2-shRNA的轉(zhuǎn)染效率達(dá)90％以上且穩(wěn)定表達(dá)，TROP2在mRNA水平的敲減率達(dá)65％以上。48小時后PC-9/shRNA組細(xì)胞的增殖抑制作用趨于明顯（P<0.05）。劃痕實驗中PC-9/shRNA組劃痕寬度較其它二組顯著增寬(P<0.001)。Transwell侵襲實驗中，相對于PC-9組和PC-9/Con組的結(jié)果之間無明顯差異(P>0.05)，PC-9/shRN

9、A組的侵襲細(xì)胞數(shù)明顯減少（P<0.05）。
　　結(jié)論：LV-TROP2-shRNA成功穩(wěn)定感染NSCLC細(xì)胞系PC-9，體外實驗證實，LV-TROP2-shRNA對于PC-9細(xì)胞的增殖、遷移、侵襲能力有抑制作用。
　　第四部分TROP2在肺癌發(fā)生、發(fā)展中作用的體內(nèi)研究
　　目的：研究LV-TROP2-shRNA對PC-9荷瘤SCID小鼠模型生長行為的影響。
　　方法：分別將三組細(xì)胞（分組同前）接種SCID鼠，建立

10、人源化SCID鼠肺癌模型，半定量RT-PCR和Western blot檢測小鼠腫瘤組織TROP2 mRNA和蛋白表達(dá)變化。檢測抑制TROP2表達(dá)后，SCID鼠的體重、移植瘤的生長速度變化。移植瘤的HE染色及免疫組化檢測TROP2、Cyclin D1的表達(dá)情況。
　　結(jié)果：實驗發(fā)現(xiàn)三組荷瘤鼠體重?zé)o明顯差異。皮下移植瘤生長PC-9組和PC-9/Con組的之間無明顯差異（P>0.05），PC-9/shRNA組明顯受抑制（P<0.05）。