rap2b在肺癌中的表達(dá)及其意義.pdf

1、肺癌是嚴(yán)重威脅人類健康的惡性疾病之一,無論是發(fā)病率還是死亡率均居惡性腫瘤前列.它的發(fā)生是多基因、多階段、多因素相互作用的結(jié)果.參與肺癌發(fā)生過程的多種基因在肺癌和正常組織中的表達(dá)存在明顯的差異,發(fā)現(xiàn)和研究這些肺癌差異表達(dá)基因有助于揭示腫瘤發(fā)生發(fā)展的分子機(jī)制,又可以為肺癌的診斷、預(yù)后以及治療提供新的標(biāo)志物和靶點(diǎn). rap2b是最近運(yùn)用抑制性消減雜交技術(shù)從中國(guó)人肺鱗癌高表達(dá)文庫中篩選出的一個(gè)基因,其在文庫中存在4個(gè)獨(dú)立的EST克隆,染

2、色體定位于3q25.2.既往研究顯示多種腫瘤3q24-3q26區(qū)域出現(xiàn)高擴(kuò)增,此區(qū)域?yàn)槟[瘤研究的熱點(diǎn)區(qū)域.rap2b屬于ras癌基因超家族,并與之高度同源,既往研究顯示多種腫瘤都存在ras的突變和過度表達(dá).據(jù)此推測(cè)rap2b基因可能在肺癌的發(fā)生發(fā)展中可能起重要作用. 本研究從mRNA及蛋白水平檢測(cè)rap2b在肺癌及其對(duì)應(yīng)癌旁組織中表達(dá)水平的差異,以探討rap2b與肺癌發(fā)生發(fā)展的關(guān)系,為肺癌的早期診斷和治療尋找新的、特異性強(qiáng)的生物

3、學(xué)標(biāo)志及靶點(diǎn)提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ).材料與方法 1.標(biāo)本收集:肺癌及其癌旁組織均取自鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院(均簽訂知情同意書).年齡年齡32-76歲,其中鱗癌例18例,腺癌12例(均經(jīng)病理學(xué)診斷證實(shí)).收集的新鮮標(biāo)本立即放入液氮中,后轉(zhuǎn)入-80℃冰箱保存.2.提取組織總RNA:取50-100mg肺癌組織加入1mlTrizol于冰浴中手動(dòng)勻漿,而后低溫離心提取上清液,加入氯仿振蕩,低溫離心使之分層,提取最上透明層,加入異丙醇振蕩后離心可見白色沉淀,加

4、入75﹪乙醇洗去小分子雜質(zhì),而后在空氣中干燥,最后用50glDEPC水溶解.3.RT-PCR(反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)):測(cè)提取RNA的吸光度,計(jì)算其濃度,取同等量RNA依照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄.以β-actin基因?yàn)閰⒄?運(yùn)用半定量RT-PCR(semi-quantitative RT-PCR)技術(shù)檢測(cè)肺癌及其對(duì)應(yīng)癌旁組織的RAP2B mRNA的表達(dá)水平. 4.提取組織總蛋白:快速剪取適量標(biāo)本,0℃PBS充分洗滌,在用冰預(yù)冷的

5、懸浮緩沖液中勻漿后,-4℃ 12000rpm離心樣品10min,超聲斷裂DNA,提取上清液,測(cè)取吸光度并計(jì)算蛋白濃度,后盡快加入等體積的2×SDS凝膠加樣緩沖液,將樣品置于沸水浴中加熱10min. 5.SDS-PAGE 分離蛋白:應(yīng)用12﹪的十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離組織蛋白. 6.Western blot:將凝膠上的蛋白轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上,轉(zhuǎn)移上蛋白的硝酸纖維素膜經(jīng)封閉液封閉后,分別順

6、序與一抗、二抗雜交,用DAB進(jìn)行顯色觀察雜交效果并確定目的蛋白的位置,最后在暗室中用ECL(化學(xué)發(fā)光法)法曝光顯色. 7.照相:應(yīng)用Bioimaging System成像分析系統(tǒng)掃描,并用Gene Tool軟件分析各蛋白條帶,將結(jié)果保存. 8.統(tǒng)計(jì)學(xué)處理:所獲資料采用統(tǒng)計(jì)分析軟件SAS9.13軟件處理,rap2b mRNA和蛋白的相對(duì)表達(dá)量以中位數(shù)Median(P<,25>-P<,75>)表示,兩組間比較采用秩和檢驗(yàn),率

7、的比較采用卡方檢驗(yàn),檢驗(yàn)水準(zhǔn)為α=0.05. 結(jié)果 1.RT-PCR半定量結(jié)果表明RAP2B mRNA在癌組織的相對(duì)表達(dá)量為0.155(0.000-0.530),在癌旁組織的相對(duì)表達(dá)量為0.000(0.000-0.160),兩者間的差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05). 2.Western blot半定量結(jié)果表明RAP2B蛋白在癌組織的相對(duì)表達(dá)量為0.195(0.050-0.580),在癌旁組織的相對(duì)表達(dá)量為0.0

8、30(0.000-0.180),兩者間的差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05). 3.rap2b mRNA在肺癌組織的檢出率為73.3﹪(22/30),在對(duì)應(yīng)癌旁組織的檢出率為30.0﹪(9/30),兩者間的差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);RAP2B蛋自在肺癌組織的檢出率為80.0﹪(24/30),在對(duì)應(yīng)癌旁組織的檢出率為60.0﹪(18/30),兩者間的差異沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05). 4.肺腺癌和肺鱗癌中rap2