葒草抗心肌細(xì)胞氧化損傷物質(zhì)基礎(chǔ)及藥代動力學(xué)研究.pdf

1、葒草為蓼科植物葒草Polygonum orientale L.的干燥全草。為貴州省少數(shù)民族地區(qū)常用藥物，收載于《貴州省中藥、民族藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)》中，具有清熱解毒，祛風(fēng)除濕，活血消腫之功效，民間常用于冠心病，心胃氣痛，風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎，疝氣，腳氣，瘡腫等疾病的治療。為了更好的開發(fā)利用葒草的藥用資源，本課題對葒草的化學(xué)成分、質(zhì)量控制、抗心肌缺血作用研究以及藥代動力學(xué)進(jìn)行了系統(tǒng)研究，為闡明葒草治療缺血性心臟病的物質(zhì)基礎(chǔ)及進(jìn)一步研究開發(fā)提供了科學(xué)依據(jù)。

2、
　　一、葒草化學(xué)成分及質(zhì)量控制研究
　　采用聚酰胺柱色譜、正反相硅膠柱色譜、凝膠柱色譜、高壓制備液相色譜等分離純化技術(shù)對葒草進(jìn)行化學(xué)成分研究，并結(jié)合現(xiàn)代波譜分析技術(shù)和理化方法鑒定其結(jié)構(gòu)。從葒草水煮醇沉后的聚酰胺吸附乙醇洗脫部位中分離、鑒定了23個化合物，其中商陸素-3-O-β-D-半乳糖苷（ombuine-3-O-β-D-galactopyranoside），商陸素-3-O-蕓香糖苷（ombuine-3-O-rutinos

3、ide），色氨酸（tryptophan）3個化合物為首次從蓼屬植物中分離得到，楊梅苷（myricitrin），沒食子酸（gallic acid），兒茶素（catechin），原兒茶酸（protocatechuic acid），對-羥基桂皮酸(p-hydroxycinnamic acid），木犀草素（luteolin），槲皮素-3-甲醚(quercetin-3-O-methyl ether），山奈素-3-O-(2′′-O-α-L-鼠李糖基

4、)-β-D-葡萄糖醛酸苷（Kaempferol-3-O-(2′′-O-α-L-rhamnopyranosyl)-β-D-glucuronopyranoside），槲皮素-3-O-(2′′-O-α-L-鼠李糖基)-β-D-葡萄糖醛酸苷（ouercetin-3-O-(2′′-O-α-L-rhamnopyranosyl)-β-D- glucuronopyranoside），槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖醛酸苷（quercetin-3-O-β-

5、D-glucuronide）等10個化合物為首次從葒草中分離得到。研究建立了葒草藥材中化學(xué)成分的超高效液相色譜電噴霧質(zhì)譜（UPLC-PDA-ESI/MS）分析方法，獲得了較好的分離和檢測，共鑒定出22個化學(xué)成分，其中3個為酚酸類成分，18個為黃酮類成分，適用于葒草藥材中化學(xué)成分的快速定性鑒定，為葒草藥材的質(zhì)量控制提供了有力證據(jù)。進(jìn)一步采用超高效液相色譜（UPLC）法建立了葒草藥材主要黃酮類成分的含量測定方法，同時測定了葒草藥材中異葒草素

6、、葒草素、槲皮素-3-O-(2″-O-α-鼠李糖)-β-葡萄糖醛酸、蘆丁、楊梅苷、牡荊素、槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖苷、木犀草苷、槲皮苷9個黃酮類成分的含量。并運(yùn)用此分析方法對貴州不同產(chǎn)地和不同采收期的葒草藥材進(jìn)行了質(zhì)量評價。本研究建立的分析方法簡便、快速、準(zhǔn)確，適用于葒草藥材的質(zhì)量控制。
　　二、葒草抗H2O2所致心肌細(xì)胞氧化損傷的保護(hù)作用及物質(zhì)基礎(chǔ)研究
　　采用血清藥理學(xué)與血清藥物化學(xué)的研究方法，建立體外培養(yǎng)H9c2

7、心肌細(xì)胞的H2O2氧化損傷模型，考察葒草含藥血清對氧化損傷心肌細(xì)胞的保護(hù)作用及其作用機(jī)制。通過比較葒草提取液、葒草給藥后含藥血清及空白血清的UPLC指紋圖譜，尋找含藥血清中的移行成分，并通過含藥血清譜（血中移行成分指紋圖譜峰面積）與效（含藥血清的藥理效應(yīng)）相關(guān)性分析，探討葒草發(fā)揮抗氧化損傷作用的體內(nèi)直接作用物質(zhì)。結(jié)果顯示，葒草含藥血清能夠減少H2O2氧化損傷心肌細(xì)胞LDH的釋放，脂質(zhì)代謝產(chǎn)物MDA的含量，顯著升高細(xì)胞存活率和SOD活性；

8、上調(diào)H2O2氧化損傷心肌細(xì)胞抗凋亡因子Bcl-2基因及蛋白的表達(dá)，使Bcl-2/Bax值升高，下調(diào)凋亡執(zhí)行效應(yīng)子Caspase-3基因及蛋白的表達(dá)，說明葒草具有抗H2O2所致心肌細(xì)胞凋亡的保護(hù)作用。在大鼠灌胃葒草提取液后的含藥血清中檢測到16個移行成分，其中4個為原型吸收入血成分，經(jīng)UPLC-ESI-MS/MS鑒定為原兒茶酸、葒草素、牡荊素、槲皮苷，其余12個移行成分推測為葒草在體內(nèi)轉(zhuǎn)化的代謝產(chǎn)物，或機(jī)體吸收葒草中成分后產(chǎn)生的應(yīng)激性成分

9、。并通過進(jìn)一步含藥血清譜-效關(guān)系分析，發(fā)現(xiàn)葒草含藥血清中的原兒茶酸、牡荊素及 m3， m4，m5，m8，m10和 m12號色譜峰所表征的化學(xué)成分與葒草抗氧化活性呈正相關(guān)，可能為其發(fā)揮抗氧化損傷保護(hù)作用的體內(nèi)直接作用物質(zhì)。
　　三、葒草大鼠離體翻轉(zhuǎn)腸囊腸吸收及藥代動力學(xué)研究
　　利用大鼠離體腸囊外翻模型，考察不同濃度葒草提取物中原兒茶酸，異葒草素，葒草素，牡荊素，木犀草苷，槲皮苷和山奈素鼠李糖苷等7個指標(biāo)成分在十二指腸、空腸、

10、回腸、結(jié)腸的吸收情況，并考察不同質(zhì)量濃度及 P-糖蛋白抑制劑對小腸吸收的影響。結(jié)果顯示，葒草提取物不同濃度時原兒茶酸等7種成分在不同腸段的吸收均為線性吸收，符合零級吸收速率，隨著藥液質(zhì)量濃度上升，腸吸收速率(Ka)增加。主要吸收部位在小腸，P-糖蛋白抑制劑不影響葒草提取物的腸吸收，說明葒草提取物不是P-糖蛋白的底物。建立UPLC-ESI-MS/MS測定大鼠血漿中原兒茶酸、異葒草素、葒草素和牡荊素的分析方法，研究大鼠口服及靜注給予葒草提取

11、物后的藥代動力學(xué)特征。大鼠給予葒草提取物后，在不同時間點(diǎn)取血測定各檢測成分血藥濃度，采用DAS2.0軟件計算藥動學(xué)參數(shù)。結(jié)果顯示，大鼠口服葒草提取物后，原兒茶酸等4個指標(biāo)成分能夠較為快速的進(jìn)入體內(nèi)， Tmax為0.38～1.42 h，MRT0-t為13.1～15.7 h、AUC(0-t)為592.0～2485.1μg/L*h；大鼠靜注葒草提取物后，原兒茶酸等4個指標(biāo)成分在大鼠體內(nèi)消除較快，MRT0-t為21.7～28.5 min、AUC