正常人白細(xì)胞介素10血清濃度、啟動(dòng)子區(qū)域基因多態(tài)性分析及其與血脂水平相關(guān)性研究.pdf

1、背景和目的 白細(xì)胞介素10(interleukin-10，IL-10)又稱為細(xì)胞因子合成抑制因子(cytokinesynthesisinhibitoryfactor，CSIF)，被認(rèn)為是體內(nèi)最為重要的抗炎因子，主要由Th2細(xì)胞合成，靶細(xì)胞包括B淋巴細(xì)胞、胸腺細(xì)胞、肥大細(xì)胞和巨噬細(xì)胞，具有抑制Th1細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞因子、抑制巨噬細(xì)胞的功能和促進(jìn)肥大細(xì)胞、胸腺細(xì)胞和B淋巴細(xì)胞分裂、增殖等作用。IL-10功能廣泛，有抑制細(xì)胞免疫和抗炎癥反

2、應(yīng)兩大生物學(xué)活性，以抗炎作用尤為突出。 人類白細(xì)胞介素10(humaninterleukin-10，hIL-10)基因啟動(dòng)子區(qū)域存在多個(gè)基因多態(tài)位點(diǎn)，包括轉(zhuǎn)錄起始區(qū)上游1.2kb和4kb處兩個(gè)CA重復(fù)序列區(qū)域的微衛(wèi)星多態(tài)性及-1082(G/A)、-819(C/T)和-592(C/A)三個(gè)連鎖點(diǎn)突變，其中-1082(G)等位基因與IL-10高表達(dá)密切相關(guān)，聯(lián)系IL-10的細(xì)胞免疫抑制和抗炎作用，IL-10啟動(dòng)區(qū)基因多態(tài)性與各種疾病

3、的發(fā)病、嚴(yán)重程度及預(yù)后之間的關(guān)系，以及其在Crohn病、類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、丙型肝炎和牛皮癬等多種急慢性炎癥和自身免疫性疾病的發(fā)病機(jī)制和臨床應(yīng)用中的作用受到了越來越多的關(guān)注，其結(jié)果均提示IL-10基因多態(tài)性可能與疾病易感性相關(guān)。此外在一些研究中發(fā)現(xiàn)急性心肌梗死病人的IL-10濃度和高密度脂蛋白HDL-C、甘油三酯TG濃度間存在相關(guān)系，而IL-10基因敲除鼠經(jīng)15周的致動(dòng)脈粥樣硬化(Atherosclerosis，AS)飲食喂養(yǎng)之后發(fā)現(xiàn)，其血中

4、HDL-C濃度(40±16mg/dl)明顯低于野生型小鼠和IL-10轉(zhuǎn)基因鼠。這些結(jié)果都暗示IL-10與血脂間可能存在某種相關(guān)性。 基于以上考慮，我們以正常中國人群為對象，通過檢測其IL-10血清濃度、啟動(dòng)區(qū)基因多態(tài)性及血脂濃度觀察并分析：1)IL-10啟動(dòng)子區(qū)-592，-819及-1082位點(diǎn)各等位基因和不同基因型的分布；2)IL-10啟動(dòng)子區(qū)基因多態(tài)性和血脂水平的關(guān)系；3)IL-10血清濃度與血脂水平的相關(guān)性。 研究

5、對象 隨機(jī)抽取南方醫(yī)科大學(xué)附屬南方醫(yī)院體檢中心體檢200例漢族人群，年齡21-62歲，平均34.09±6.38歲，其中女27例，男127例。所有對象均經(jīng)過系統(tǒng)查體、血壓、肝腎功能和血常規(guī)檢查，并詳細(xì)詢問并記錄患者高血壓、糖尿病、心臟病、吸煙及飲酒史。有明顯的肝腎或心功能衰竭、嚴(yán)重感染或惡性疾病，近4周有潛在感染體征及癥狀、外科手術(shù)和外傷史、風(fēng)濕性心臟病和口服降脂藥物樣本均排除在外。無遺傳病家族史，相互間無親緣關(guān)系。 方法

6、 1.應(yīng)用DNA提取試劑盒提取EDTA抗凝血標(biāo)本基因組DNA，并于4℃保存，取未抗凝血分離血清-20℃保存； 2.分別以MaeⅢ、RsaⅠ、XagⅠ為限制性內(nèi)切酶，應(yīng)用聚合酶鏈反應(yīng)-限制性片段長度多態(tài)性分析(polymerasechainreaction-restrictionfragmentpolymorphismsassay，PCR-RFLP)，聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測DNA標(biāo)本IL-10啟動(dòng)子區(qū)-592，-819，-

7、1082位點(diǎn)基因多態(tài)性； 3.應(yīng)用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)ELISA法檢測待測血清標(biāo)本IL-10濃度； 4.由OLYMPUSAU5421大型全自動(dòng)生化分析儀檢測待測標(biāo)本血清總膽固醇TC、甘油三酯TG、高密度脂蛋白膽固醇HDL、低密度脂蛋白膽固醇LDL和極低密度脂蛋白VLDL。 結(jié)果 1.對200例正常人IL-10基因的3個(gè)多態(tài)位點(diǎn)-1082、-819和-592進(jìn)行檢測，擴(kuò)增全部DNA樣品，剔除無產(chǎn)物者，實(shí)際可用樣

8、本數(shù)為：-1082位點(diǎn)131例結(jié)果，-819、-592位點(diǎn)142例。結(jié)果表明，IL-10基因啟動(dòng)子的-1082、-819、-592位點(diǎn)均含有2個(gè)等位基因(-1082G/A、-819C/T、-592C/A)，-1082兩種基因型(GA、AA)、-819三種基因型(CC、CT、TT)，-592三種基因型(CC、CA、AA)；-592和-819位點(diǎn)基因型高度連鎖，即-592CC和-819CC、-592CA和-819TC、-592AA和-819

9、TT總是同時(shí)出現(xiàn)，-1082位點(diǎn)未發(fā)現(xiàn)有GG基因型的存在。-1082AA基因型為91.6％，AG基因型為8.4％，GG基因型為0％，-592AA/-819TT基因型為40.1％，-592AC/-819TC基因型為40.8％，-592CC/-819CC基因型為19.0％。 2.檢測樣本中IL-10啟動(dòng)子區(qū)-512、-819和-1082三個(gè)位點(diǎn)等位基因頻率，-1082位點(diǎn)A等位基因頻率為96％，G等位基因頻率為4％，-592C/-8

10、19C等位基因頻率為39％，-592A/-819T等位基因頻率為61％。漢族人群與英國、意大利高加索人種相比，漢族人群-1082位點(diǎn)G等位基因攜帶率顯著降低(4％vs.49％，x2=180.74，P＜0.001；4％vs.37％，x2=109.77，P＜0.001)，-592位點(diǎn)A等位基因攜帶率高(61％vs.23％，x2=152.60，P＜0.001；61％vs.29％，x2=110.47，P＜0.001)，特別是-1082位點(diǎn)基因型

11、構(gòu)成差異最大，而與韓國人相比未發(fā)現(xiàn)具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的差異。 3.正常受檢者IL-10基因啟動(dòng)子的-1082、-819和-592三個(gè)位點(diǎn)的各基因型年齡構(gòu)成差異不顯著，與血脂水平關(guān)系的分析結(jié)果表明，IL-10-592(AA、CA、CC)和-819位點(diǎn)(CC、CT、TT)基因型間的血脂水平無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)；IL-10-1082位點(diǎn)，GA基因型的HDL濃度高于AA型，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(1.514±0.501mmol/Lvs.1.2

12、61±0.346mmol/L，t=-2.225，P=0.028)，但TC、TG、LDL血清濃度無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。 4.檢測154例標(biāo)本IL-10血清濃度及血脂濃度，IL-10血清濃度與以往國內(nèi)相關(guān)研究報(bào)道的正常對照組IL-10血清濃度無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(7.668±7.308pg/mLvs.8.22±7.04pg/mL，t=0.3738，P＞0.7)。對IL-10血清濃度與TC，TG，LDL，HDL，VLDL間進(jìn)行雙變量相關(guān)分析，發(fā)現(xiàn)其相

13、關(guān)系數(shù)的P值均大于0.05，即不存在有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的相關(guān)關(guān)系。 5.比較不同血脂水平樣本對應(yīng)IL-10濃度，發(fā)現(xiàn)高膽固醇與正常膽固醇標(biāo)本、高甘油三酯與正常甘油三酯標(biāo)本、低高密度蛋白與正常高密度脂蛋白標(biāo)本，高低密度脂蛋白與正常低密度脂蛋白標(biāo)本間IL-10血清濃度均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)。 結(jié)論和創(chuàng)新點(diǎn) 1.中國人存在IL-10啟動(dòng)子區(qū)-1082，-819，-592位點(diǎn)基因多態(tài)性，IL-10基因啟動(dòng)子的-1082

14、、-819、-592位點(diǎn)均含有2個(gè)等位基因(-1082G/A、-819C/T、-592C/A)，-1082兩種基因型(GA、AA)、-819三種基因型(CC、CT、TT)，-592三種基因型(CC、CA、AA)；-592和-819位點(diǎn)基因型高度連鎖，即-592CC和-819CC、-592CA和-819TC、-592AA和-819TT總是同時(shí)出現(xiàn)，-1082位點(diǎn)未發(fā)現(xiàn)有GG基因型的存在。 2.IL-10啟動(dòng)子區(qū)-1082，-819

15、，-592位點(diǎn)基因多態(tài)性存在明顯的人種差異。 3.于國內(nèi)外首次發(fā)現(xiàn)IL-10-1082-位點(diǎn)，GA基因型的血清HDL濃度高于AA型，差異顯著(P＜0.05)，但TC、TG、LDL血清濃度間無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。未發(fā)現(xiàn)其-592及-819位點(diǎn)不同基因型標(biāo)本間存在各脂質(zhì)指標(biāo)血清濃度的差異。 4.我們所統(tǒng)計(jì)的數(shù)據(jù)未顯示IL-10血清濃度與TC、TG、LDL、HDL和VLDL血清濃度具有相關(guān)性，不同血脂水平標(biāo)本的IL-10血清濃度的差異