鹽酸戊乙奎醚心肺保護作用的實驗及臨床研究.pdf

1、心肺轉(zhuǎn)流術(shù)(cardiopulmonary bypass,CPB)是心內(nèi)直視手術(shù)主要的輔助手段,然而,CPB可以誘發(fā)全身炎癥反應(yīng)綜合征(systemic inflammatory responsesyndrome,SIRS),導(dǎo)致包括心、肺在內(nèi)的全身各臟器功能障礙。CPB可造成心肌損傷,嚴重時可造成術(shù)后心臟功能損害,表現(xiàn)為心律失常、心衰等并發(fā)癥。急性肺損傷(acute lung injury,ALI)是SIRS在肺臟的集中表現(xiàn),以肺內(nèi)彌

2、漫性炎癥細胞浸潤、肺毛細血管通透性增加和低氧血癥為特征。心內(nèi)直視手術(shù)術(shù)后急性呼吸功能不全的發(fā)生率高達15％-30％,由其導(dǎo)致的死亡人數(shù)占術(shù)后總死亡人數(shù)的30％。ALI在分子水平上表現(xiàn)為多種炎性介質(zhì)和炎性因子的過度釋放,促炎和抗炎反應(yīng)失衡；細胞水平上表現(xiàn)為中性粒細胞、巨噬細胞等炎性細胞的聚集和浸潤；而臨床上則表現(xiàn)為彌漫性肺泡和肺血管內(nèi)皮細胞的損傷、肺組織水腫及肺不張等病理特征,嚴重者可出現(xiàn)急性呼吸窘迫綜合征(acute respirato

3、rydistress syndrome,ARDS)。因此,抑制CPB中全身炎癥反應(yīng),探索有效的心肺保護措施對臨床工作具有重要意義。
　　 藥物干預(yù)在CPB相關(guān)SIRS的防治中具有重要作用。目前,較為確定的SIRS治療藥物有:類固醇類藥物、烏司他丁、肝素和其他葡萄糖胺聚糖、磷酸二酯酶抑制劑如米力農(nóng)和氨力農(nóng)、抗氧化劑以及硝普鈉等。但臨床應(yīng)用中存在療效不滿意和/或不良反應(yīng)嚴重的問題,至今仍無安全有效的治療藥物。傳統(tǒng)莨菪類藥物應(yīng)用于SI

4、RS治療多年,但因其對膽堿受體亞型無選擇性以及副作用大,限制了其臨床應(yīng)用。鹽酸戊乙奎醚(penehyclidine hydrochloride,PHC)是我國研發(fā)的新一代抗膽堿藥,具有選擇性M1、M3受體激動作用,對M2受體無明顯作用,作用時間長,副作用少,為臨床SIRS的防治提供了新選擇。已有的研究顯示,PHC具有改善微循環(huán)、降低毛細血管壁通透性、細胞保護以及減少溶酶體釋放等作用,提示PHC可能對CPB誘發(fā)的SIRS具有治療作用,進而

5、對SIRS導(dǎo)致的心肺損傷有保護作用。
　　 目前,關(guān)于PHC臟器保護作用的報道較多,但其作用機制的研究較少。近年來內(nèi)毒素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路成為研究熱點。動物實驗顯示,PHC可抑制內(nèi)毒素誘導(dǎo)大鼠ALI中核轉(zhuǎn)錄因子-κB(NF-κB)mRNA的表達,但PHC對內(nèi)毒素特異受體CD14和TLR4的影響尚未見報道。CD14和TLR4是內(nèi)毒素特異受體,位于信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的最上游,其激活可引起一系列下游分子的激活,最終引起NF-κB活化,使炎癥因子大

6、量表達,導(dǎo)致SIRS,甚至ALI、ARDS和MODS。由于CD14和TLR4位于信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的關(guān)鍵位置,是理想的治療靶點,因此,抑制其跨膜信號轉(zhuǎn)導(dǎo)對ALI的靶向治療具有重要意義。
　　 因此,本研究臨床試驗以瓣膜置換術(shù)患者為對象,觀察心肌組織NF-κB轉(zhuǎn)錄活性及其下游炎性因子腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、細胞間粘附分子-1(sICAM-1)及心肌肌鈣蛋白I(cTn-I)的血漿水平,探討PHC的心肌保護作用。術(shù)中監(jiān)測呼吸指數(shù)(R

7、I)、氧合指數(shù)(OI)及肺動態(tài)順應(yīng)性(Cd),觀察PHC對肺臟的保護作用。同時,建立內(nèi)毒素誘導(dǎo)大鼠 ALI模型,觀察PHC對內(nèi)毒素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中CD14、TLR4、NF-κB mRNA表達及氧化應(yīng)激的影響；進一步探討PHC的作用機制及量效關(guān)系,為臨床的合理應(yīng)用提供參考。全文共分三部分。
　　 材料和方法：
　　 1.鹽酸戊乙奎醚對CPB下瓣膜置換術(shù)患者的心肌保護作用
　　 擇期行心臟雙瓣瓣膜置換術(shù)患者60例,分為

8、常規(guī)組(C組)、鹽酸戊乙奎醚組1(P1組)、鹽酸戊乙奎醚組2(P2組),每組20例。P1組、P2組鹽酸戊乙奎醚劑量分別為0.05mg·kg-1和0.1mg·kg-1,均用生理鹽水稀釋至10ml,于切皮即刻經(jīng)中心靜脈緩慢注入,C組則給予等容量生理鹽水。于體外循環(huán)開始前(T1)、主動脈阻斷后30min(T2)及主動脈開放后30min(T3)取右心耳組織,觀察NF-κB轉(zhuǎn)錄活性和心肌組織形態(tài)學(xué)改變。并分別于靜脈注射PHC前(T1)、主動脈阻斷

9、后30 min(T2)、主動脈開放后30min(T3)、4h(T4)、24h(T5)抽取橈動脈血,檢測血漿腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、細胞間粘附分子-1(sICAM-1)及心肌肌鈣蛋白I(cTn-I)水平。并記錄上述各時間點的MAP、CVP、HR。
　　 2.鹽酸戊乙奎醚對CPB下瓣膜置換術(shù)患者肺功能的影響
　　 試驗對象、試驗分組以及給藥方法同第一部分。取第一部分各時間點采集的橈動脈血1ml做血氣分析,記錄PaCO

10、2和PaO2值,并記錄各時間點的吸入氧濃度(FiO2),以計算呼吸指數(shù)(RI)和氧合指數(shù)(OI)。并分別于氣管插管后10min(靜脈注射鹽酸戊乙奎醚前)、30min、CPB前即刻、CPB后30min及60min記錄呼吸機上潮氣量(VT)、氣道峰壓(Pmax)及呼氣末氣道正壓(PEEP)值,以計算肺動態(tài)順應(yīng)性(Cd)。
　　 3.鹽酸戊乙奎醚對內(nèi)毒素誘導(dǎo)大鼠急性肺損傷中CD14、TLR4、NF-κB基因表達及氧化應(yīng)激的影響

11、　　 32只雄性SD大鼠隨機分為4組(n=8),對照組(C組):腹腔和尾靜脈均注射生理鹽水1ml/kg；模型組(M組):腹腔注射生理鹽水1ml/kg,30min后經(jīng)尾靜脈注射脂多糖(LPS)5mg/kg,鹽酸戊乙奎醚低劑量治療組(L組)、高劑量治療組(H組)分別腹腔注射鹽酸戊乙奎醚0.3mg/kg、1mg/kg,30min后經(jīng)尾靜脈注射LPS5mg/kg。模型制備后6h處死動物,取肺組織,采用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)檢測CD

12、14、TLR4及NF-κB mRNA的表達,ELISA法測定肺組織和血清中腫瘤壞死因子-α(TNF-α)含量；分光光度計法檢測肺組織和(或)血清中髓過氧化物酶(MPO)、丙二醛(MDA)含量、超氧化物歧化酶(SOD)和乳酸脫氫酶(LDH)活力;測定肺組織濕/干重比(W/D)及含水量；光鏡下觀察肺組織形態(tài)學(xué)變化,透射電鏡下觀察肺組織超微結(jié)構(gòu)的變化。
　　 結(jié)果：
　　 1.鹽酸戊乙奎醚對CPB下瓣膜置換術(shù)患者的心肌保護作用

13、
　　 1.1 C組患者心肌組織部分區(qū)域細胞腫脹、心肌纖維橫紋模糊不清；心肌細胞間可見嗜中性粒細胞浸潤。而P1、P2組心肌組織損傷較輕,心肌細胞間僅見少量嗜中性粒細胞浸潤。
　　 1.2三組患者心肌細胞NF-κB轉(zhuǎn)錄活性于T2、T3時較CPB前明顯升高,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。鹽酸戊乙奎醚能顯著降低T2、T3時點的心肌細胞NF-κB轉(zhuǎn)錄活性(P<0.05),但P1與P2兩組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。<

14、br>　　 1.3三組患者血漿TNF-α水平在T3-T5時點較靜脈注射PHC前明顯升高(P<0.01),P1、P2組血漿TNF-α水平較C組顯著降低(P<0.05),但P1、P2兩組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。
　　 1.4三組患者血漿sICAM-1水平在T3-T5時點較靜脈注射PHC前明顯升高(P<0.01),P1、P2組血漿sICAM-1水平較C組顯著降低(P<0.05),但P1、P2兩組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0

15、.05)。
　　 1.5三組患者血漿cTn-I水平在T2-Ts時點較靜脈注射PHC前明顯升高(P<0.01),P1、P2組血漿cTn-I水平較C組顯著降低(P<0.05),但P1、P2兩組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。
　　 2.鹽酸戊乙奎醚對CPB下瓣膜置換術(shù)患者肺功能的影響
　　 2.1 P1、P2組RI在T1時與C組相比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；在T2-T5時間段,與C組相比較,P1組和P2

16、組的RI顯著低于C組,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01),而P1與P2組之間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。
　　 2.2 P1、P2組OI在T1時與C組相比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；在T2-T5時間段,與C組相比較,P1組和P2組的OI顯著高于C組,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01),而P1與P2組之間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。
　　 2.3 P1、P2組Cd在氣管插管后10min與C組相比較差異無統(tǒng)計

17、學(xué)意義(P>0.05)；在氣管插管后30min以及CPB前后各時間點,與C組相比較,P1組和P2組的Cd顯著高于C組,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01),而P1與P2組之間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。
　　 3.鹽酸戊乙奎醚對內(nèi)毒素誘導(dǎo)大鼠急性肺損傷中CD14、TLR4、NF-κB基因表達及氧化應(yīng)激的影響
　　 3.1大鼠肺組織中CD14、TLR4 mRNA表達與C組相比,M組、L組、H組大鼠肺組織中CD14、TLR

18、4 mRNA表達增加,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；與M組相比,L組及H組大鼠肺組織中CD14、TLR4 mRNA表達降低,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05),但L組和H組兩組間比較,差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。
　　 3.2大鼠肺組織中NF-κBmRNA表達與C組相比,M組、L組、H組大鼠肺組織中NF-κBmRNA表達增加,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；與M組相比,L組及H組大鼠肺組織中NF-κBmRNA表達降低,

19、差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05),同時L組和H組兩組間比較,差異亦有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。
　　 3.3大鼠肺組織和血清中TNF-α含量與C組相比,M組、L組、H組大鼠肺組織和血清中TNF-α含量增加,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05);與M組相比,L組及H組大鼠肺組織中TNF-α含量降低,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05),同時L組和H組兩組間比較,差異亦有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。
　　 3.4大鼠肺組織中MPO

20、活性與C組相比,M組、L組、H組大鼠肺組織中MPO活性增加,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；與M組相比,L組及H組大鼠肺組織中MPO活性降低,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05),同時L組和H組兩組間比較,差異亦有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。
　　 3.5大鼠肺組織和血清中MDA含量與C組相比,M組、L組、H組大鼠肺組織和血清中MDA含量增加,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；與M組相比,L組及H組大鼠肺組織和血清中MDA含量降低

21、,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05),同時L組和H組兩組間比較,差異亦有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。
　　 3.6大鼠肺組織中和血清中SOD活力與C組相比,M組、L組、H組大鼠肺組織和血清中SOD活力降低,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；與M組相比,L組及H組大鼠肺組織中和血清中SOD活力升高,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05),同時L組和H組兩組間比較,H組SOD活力升高,差異亦有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。
　　 3.

22、7大鼠血清中LDH活力與C組相比,M組、L組、H組大鼠血清中LDH活力增加,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；與M組相比,L組及H組大鼠血清中LDH活力降低,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05),同時L組和H組兩組間比較,H組血清中LDH活力降低,差異亦有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。
　　 3.8鹽酸戊乙奎醚對急性肺損傷大鼠肺W/D值及肺含水量影響與C組相比,M組、L組、H組大鼠肺W/D值及肺含水量增加,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.0

23、5)；與M組相比,L組及H組大鼠肺W/D值及肺含水量降低,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05),同時L組和H組兩組間比較,H組大鼠肺W/D值及肺含水量降低,差異亦有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。
　　 3.9鹽酸戊乙奎醚對肺組織病理改變的影響光鏡及電鏡觀察,C組肺組織結(jié)構(gòu)正常,M組肺組織結(jié)構(gòu)嚴重損傷,L組及H組肺組織損傷較M組減輕,同時L組和H組兩組間比較,H組大鼠肺組織損傷較L組減輕。
　　 結(jié)論：
　　 1.體外循

24、環(huán)介導(dǎo)的全身炎癥反應(yīng)可引起心肌細胞NF-κB轉(zhuǎn)錄活性、血漿TNF-α、sICAM-1及cTn-I水平升高,鹽酸戊乙奎醚可以通過抑制全身炎癥反應(yīng)減輕心肌損傷,對體外循環(huán)下瓣膜置換術(shù)患者的心肌具有保護作用。
　　 2.鹽酸戊乙奎醚可明顯降低瓣膜置換術(shù)患者RI、升高OI及Cd,改善肺功能狀態(tài),具有肺保護作用。
　　 3.鹽酸戊乙奎醚可抑制內(nèi)毒素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中CD14、TLR4及NF-κB mRNA表達,降低TNF-α、MPO、