鹽酸戊乙奎醚對腦損傷大鼠神經(jīng)保護效應及其機制的研究.pdf

1、目的：
　　 腦卒中是當今世界上最重要的致死性疾病之一，中國人群腦卒中發(fā)病率、死亡率在總死亡中所占比例，城市為20％，農(nóng)村為19％。而在腦卒中中，缺血性中風占80％以上。臨床上處理腦缺血性損傷的原則是盡早恢復血液再灌注，然而近年來發(fā)現(xiàn)，恢復缺血區(qū)的血供后，在一定程度上反而更加重了缺血性腦損傷，使腦細胞死亡數(shù)量進一步增加，加重病情，這種血流再通后引起的繼發(fā)性損傷稱為腦缺血再灌注損傷(cerebral ischemia reperf

2、usion injury CIRI)，腦缺血再灌注損傷的存在使腦組織的功能障礙和結構損傷更嚴重，死亡率更高，大大降低了治療效果，引起世人的廣泛關注，成為近年來腦缺血研究的一個熱點。
　　 腦缺血再灌注損傷是一復雜的病理生理過程，其具體機制目前尚不完全清楚。近年來的研究發(fā)現(xiàn)，腦血流中斷和再灌注使腦的細胞產(chǎn)生損傷是一個快速的級聯(lián)反應，這個級聯(lián)反應包括許多環(huán)節(jié)，如能量障礙、氧自由基的大量釋放、細胞酸中毒、興奮性氨基酸釋放增加、細胞內(nèi)鈣

3、失穩(wěn)態(tài)、自由基生成、凋亡基因激活等。這些環(huán)節(jié)互為因果，彼此重疊，并相互聯(lián)系，形成惡性循環(huán)，最終導致細胞凋亡或壞死。本文旨在通過理論、實驗、臨床諸方面研究，以探討鹽酸戊乙奎醚對大鼠局灶性腦缺血模型神經(jīng)細胞的保護效應與機制，為防治缺血性腦病更為深入的醫(yī)藥研究提供理論依據(jù)。
　　 實驗方法：
　　 采用實驗手段，探討鹽酸戊乙奎醚對大鼠局灶性腦缺血模型神經(jīng)細胞保護效應及其機制。在復制大鼠局灶性腦缺血病理模型的基礎上，將實驗動物S

4、D大鼠(250g～300g)，分為假手術組、模型組、鹽酸戊乙奎醚高劑量組、鹽酸戊乙奎醚中劑量組、鹽酸戊乙奎醚低劑量組、東莨菪堿組。假手術組:僅分離右側大腦中動脈不夾閉;模型組:腦缺血再灌注前后不行任何治療措施;鹽酸戊乙奎醚低劑量組:在缺血前20min ip鹽酸戊乙奎醚0.026mg/kg;鹽酸戊乙奎醚中劑量組:在缺血前20min ip鹽酸戊乙奎醚0.08mg/kg;鹽酸戊乙奎醚高劑量組:在缺血前20minip鹽酸戊乙奎醚0.24mg/k

5、g;東莨菪堿(Sco)組:在缺血前20min ip東莨菪堿0.1mg/kg，大鼠缺血再灌注24h后作相應處理，取樣本，進行各項檢測實驗。運用光鏡與電鏡觀察各組腦組織神經(jīng)細胞損害情況，通過比較各組腦梗塞體積，探討鹽酸戊乙奎醚對局灶性腦缺血神經(jīng)元損傷的保護效應;通過免疫組化實驗，計算各組神經(jīng)元TUNEL染色及Bcl-2、Caspase-3免疫組化染色陽性細胞數(shù)，探討鹽酸戊乙奎醚對大鼠局灶性腦缺血神經(jīng)元凋亡及其相關基因表達的影響;對各組氧自由

6、基相關物進行檢測，其中SOD檢測用黃嘌呤氧化酶法，MDA檢測用TBA顯色法，探討鹽酸戊乙奎醚對大鼠局灶性腦缺血腦組織中氧自由基的影響;用氨基酸分析儀測定各組興奮性氨基酸的含量，探討鹽酸戊乙奎醚對大鼠局灶性腦缺血腦組織中興奮性氨基酸的影響。
　　 選取1日齡Wistar新生大鼠，雌雄不限，75％乙醇消毒后，剝離頭皮及顱骨，取出完整腦組織，鈍性分離海馬，原代培養(yǎng)大鼠海馬神經(jīng)元。根據(jù)再灌注不同時間(1h，6h，12h，24h)及藥物不

7、同濃度(1.6μmol· L-1，0.4μmol·L-1，0.1μmol·L-1)將神經(jīng)元隨機分4大組:①正常對照組:正常換液培養(yǎng)。②低糖低氧再灌注損傷組:換以無糖Hank’s液后置于缺氧盒中，并向內(nèi)通入100％N2作用2h后，換以完全培養(yǎng)基模擬體內(nèi)缺血再灌注的過程。③藥物處理組:換以無糖Hank’s液以后分別加入低、中、高三個濃度的鹽酸戊乙奎醚，其他處理同②組。④MK-801對照組:換以無糖Hank's液以后加入MK-801，其他處理

8、同②組。每組細胞均在倒置相差顯微鏡下動態(tài)觀察低糖低氧再灌注不同時間一般形態(tài)學變化，RT-PCR半定量檢測NMDA受體NR1亞基mRNA的表達，本實驗選用大鼠的海馬神經(jīng)元作為研究對象，建立缺糖缺氧再灌注模型，RT-PCR法測定缺糖缺氧再灌注海馬神經(jīng)元NMDA受體NR1亞基mRNA表達，探討鹽酸戊乙奎醚對缺糖缺氧大鼠海馬神經(jīng)元NMDA受體的作用。
　　 實驗結果：
　　 光鏡下可見模型組空泡形成明顯，部分神經(jīng)元周圍間隙擴大，

9、神經(jīng)細胞死亡多，殘存細胞少，鹽酸戊乙奎醚組神經(jīng)細胞較為致密，胞漿濃縮較輕，神經(jīng)細胞死亡減少;對細胞的超微結構的電鏡觀察發(fā)現(xiàn)，模型組細胞結構嚴重破壞，壞死與凋亡兩種細胞死亡形態(tài)均出現(xiàn)，鹽酸戊乙奎醚組細胞結構較完整;與模型組比較，鹽酸戊乙奎醚組腦梗塞體積顯著減小(P＜0.05);與假手術組對比，模型組腦組織TUNEL染色、Caspase-3免疫組化染色陽性細胞數(shù)升高(P＜0.001)，Bcl-2免疫反應陽性細胞數(shù)下降(P＜0.001);與模

10、型組對比，鹽酸戊乙奎醚組降低腦組織TUNEL染色陽性細胞數(shù)與Caspase-3免疫反應陽性細胞數(shù)，增加Bcl-2免疫反應陽性細胞數(shù)(P＜0.001);鹽酸戊乙奎醚能提高缺血后腦組織中SOD活性并降低MDA含量;與假手術組對比，模型組腦組織Glu、Asp、Gly、 GABA含量升高(Pglu=0.012，Pasp＜0.001，Pgly＜0.001，PGABA=0.003)，與模型組對比，鹽酸戊乙奎醚三個劑量組均可降低腦組織Glu、Asp、

11、Gly含量(P＜0.05)，鹽酸戊乙奎醚三劑量組能降低腦組織GABA含量，但差異無顯著性。RT-PCR結果顯示除缺糖缺氧再灌注1h組各藥物作用不明顯，鹽酸戊乙奎醚低、中、高濃度及MK-801在其他再灌注時間點均降低NR1亞基mRNA表達。
　　 結論：
　　 1、鹽酸戊乙奎醚減輕大鼠局灶性腦缺血模型神經(jīng)細胞的損害，對腦缺血神經(jīng)細胞有保護效應。
　　 2、鹽酸戊乙奎醚能通過影響凋亡相關基因的表達，對抗大鼠局灶性腦缺

12、血后神經(jīng)細胞的凋亡變化，從而產(chǎn)生對腦缺血后神經(jīng)細胞的保護作用。
　　 3、鹽酸戊乙奎醚能調(diào)控缺血后腦組織中SOD活性與MDA含量，從而減弱自由基的毒性反應。
　　 4、鹽酸戊乙奎醚可調(diào)控缺血后腦組織中興奮性氨基酸含量，拮抗興奮性氨基酸的毒性反應，從而起到對神經(jīng)細胞的保護作用。
　　 5、鹽酸戊乙奎醚減少NMDA受體NR1亞基mRNA的表達，鹽酸戊乙奎醚可能通過作用于NMDA受體減輕海馬神經(jīng)元缺血缺氧再灌注損傷發(fā)揮