黃連素聯(lián)合頭孢他啶對產(chǎn)超廣譜β-內(nèi)酰胺酶大腸埃希菌抑菌作用的研究.pdf

1、隨著各種抗生素的廣泛使用，細(xì)菌的耐藥性問題變得越來越突出，嚴(yán)重威脅著人類健康，已成為人們必須面對的一個(gè)難題。特別是產(chǎn)超廣譜β-內(nèi)酰胺酶(ESBLs)大腸埃希菌的發(fā)現(xiàn)，使得這一問題更加嚴(yán)峻。中藥成分復(fù)雜，可作用于細(xì)菌的多個(gè)代謝環(huán)節(jié)，而現(xiàn)代藥理學(xué)的研究證明，許多中藥都有較強(qiáng)的抑菌作用。中西藥聯(lián)用可以發(fā)揮各自優(yōu)勢，取得優(yōu)于單獨(dú)使用中藥或西藥的綜合療效。黃連素的抗菌譜廣，近年來也認(rèn)為其能消除細(xì)菌耐藥質(zhì)粒，黃連素對多種細(xì)菌有抑制作用，但對產(chǎn)ESB

2、Ls大腸埃希菌的研究較少。頭孢他啶為第三代頭孢菌素類，抗菌譜廣，抗菌作用強(qiáng)，對多種β-內(nèi)酰胺酶穩(wěn)定。但由于不合理的應(yīng)用，引起頭孢他啶對革蘭陰性桿菌的耐藥日益增多。研究黃連素聯(lián)合頭孢他啶對產(chǎn)ESBLs大腸埃希菌的抑菌作用、β-內(nèi)酰胺酶活性以及質(zhì)粒的消除，為臨床中西醫(yī)結(jié)合治療產(chǎn)ESBLs耐藥菌提供用藥依據(jù)。 目的：研究黃連素與頭孢他啶聯(lián)合應(yīng)用對產(chǎn)ESBLs的大腸埃希菌的抑菌作用；探討黃連素與頭孢他啶聯(lián)用對產(chǎn)ESBLs大腸埃希菌β-內(nèi)

3、酰胺酶活性的影響以及對質(zhì)粒的消除作用。 方法：1.采用液體兩倍稀釋法測定頭孢他啶對23株產(chǎn)ESBLs大腸埃希菌株的MIC、MBC；瓊脂稀釋法測定硫酸黃連素的MIC。 2.臨床分離菌4號(hào)、8號(hào)、23號(hào)產(chǎn)ESBLs大腸埃希菌株，采用肉湯稀釋棋盤法，分別對其進(jìn)行聯(lián)合抑菌效果的測定，以部分抑菌濃度(Fractionalinhibitoryconcentrationindex簡稱FIC)作為聯(lián)合藥敏試驗(yàn)判斷依據(jù)。 頭孢他啶

4、對三株菌的MIC及抑菌圈直徑分別為32μg/ml、22mm；64μg/ml、17mm；256μg/ml、11mm；4號(hào)、8號(hào)、23號(hào)分別定義為耐藥菌、中度耐藥菌、高度耐藥菌。 3.采用Kirby-Bauer(K-B)法對23株產(chǎn)ESBLs大腸埃希菌做單獨(dú)頭孢他啶及頭孢他啶+硫酸黃連素的聯(lián)合藥敏試驗(yàn)。 4.β-內(nèi)酰胺酶提取液：過夜肉湯培養(yǎng)液，5160g，4℃離心10min，棄上清，沉淀用pH7.0，0.01mol/L磷酸鹽

5、緩沖液洗兩遍，將沉淀懸浮于適量0.01mol/L，pH7.0磷酸鹽緩沖液中，用超聲碎石機(jī)在冰浴條件下將菌體破碎。破碎后菌液離心，38600g，4℃，1h。上清液即為β-內(nèi)酰胺酶提取液，-70℃保存。 5.β-內(nèi)酰胺酶定性測定及酶活性測定5.1用Nitrocefin作酶的定性檢測。 5.2β-內(nèi)酰胺酶的活性單位用每mg酶蛋白在37℃pH7.0時(shí)每分鐘能水解Nitrocefin的nmol數(shù)來表示(U/mg)，以10-4MNi

6、trocefin為低物，在紫外分光光度計(jì)波長482nm處進(jìn)行時(shí)間掃描測定酶活性，粗酶提取液為0.1ml，在Nitrocefin中加入酶后每隔1分鐘記錄光密度(OD)值的變化，時(shí)間掃描10min。依據(jù)OD值的變化求酶活性。酶活性=(X/1.59))×0.3V(X為482nm處的OD值，V為酶體積換算到1ml)。 6.質(zhì)粒消除試驗(yàn)6.1質(zhì)粒提?。喊凑召|(zhì)粒提取試劑盒操作步驟進(jìn)行。 6.2.瓊脂糖凝膠電泳，紫外透射反射分析儀下觀

7、察，照相機(jī)拍攝，比較單獨(dú)用頭孢他啶、黃連素，以及聯(lián)合應(yīng)用前后的電泳圖譜，分析藥物對質(zhì)粒的消除作用。 結(jié)果：1.23株產(chǎn)ESBLs大腸埃希菌對頭孢他啶的MIC、MBC分別為4～512μg/ml、4～512μg/ml,對硫酸黃連素的MIC為32～128mg/ml。頭孢他啶的MIC90為19.56μg/ml，硫酸黃連素MIC90為35.74mg/ml。 2.頭孢他啶+硫酸黃連素聯(lián)合藥敏試驗(yàn)對耐藥菌4號(hào)、8號(hào)、23號(hào)FIC表現(xiàn)均

8、為相加作用。 3.23株產(chǎn)ESBLs大腸埃希菌藥敏試驗(yàn)表現(xiàn)為頭孢他啶聯(lián)合硫酸黃連素比單用頭孢他啶的藥敏抑菌環(huán)直徑增大，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 4.β-內(nèi)酰胺酶活性測定，單用硫酸黃連素及頭孢他啶聯(lián)合硫酸黃連素培養(yǎng)的菌液與未用任何藥物培養(yǎng)的菌液(肉湯菌)β-內(nèi)酰胺酶活性降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；而單用頭孢他啶與肉湯菌相比較差異沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；不同濃度的硫酸黃連素和不同濃度的頭孢他啶聯(lián)用所測β-內(nèi)酰胺酶活性之間差異沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；單

9、用硫酸黃連素與硫酸黃連素聯(lián)合頭孢他啶之間差異沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；而單用硫酸黃連素和單用頭孢他啶之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 5.硫酸黃連素、頭孢他啶以頭孢他啶聯(lián)合硫酸黃連素對產(chǎn)ESBLs大腸埃希菌的質(zhì)粒均有一定的消除作用。 結(jié)論：1.黃連素對產(chǎn)ESBLs大腸埃希菌具有抑菌作用。 2黃連素聯(lián)合頭孢他啶對產(chǎn)ESBLs大腸埃希菌聯(lián)合藥敏結(jié)果呈相加作用。 3.黃連素及黃連素聯(lián)合頭孢他啶可抑制產(chǎn)ESBLs大腸埃希菌的β-內(nèi)酰