TRPV及TRPM離子通道家族在生殖細胞中的表達及相關功能研究.pdf

1、弱精子癥是引起男性不育的常見病因之一，約占男性不育病因的30%。以往己知造成弱精子癥的病因包括感染、精漿異常、精索靜脈曲張、內分泌異常、自身免疫異常和精子鞭毛結構缺陷等，但有關弱精子癥的分子病因及具體發(fā)病機制仍不清楚。隨著以精子為對象的研究日益深入，人們發(fā)現(xiàn)離子跨膜轉運對維持精子正常生理活動非常重要。離子通道在精子生理活動包括精子運動、獲能、精子頂體反應和精卵結合等過程中起著重要作用。新近研究表明，離子通道的表達異常與弱精子癥關系密切。

2、目前已知，人類精子中存在多種離子通道，包括陽離子通道和陰離子通道，其中TRP、CatSper及Kca+與精子的運動功能關系密切，已成為男性生殖醫(yī)學研究的熱點。 近年來，有關TRP通道在睪丸細胞中的表達及相關功能研究越來越受到重視。迄今為止，共有6種TRPC通道（包括TRPC1、2、3、4、5和6）在小鼠睪丸生精細胞中的表達得以證實。Jungnickel等研究顯示，TRPC2定位于精子頭部，對于維持持續(xù)的鈣內流以觸發(fā)頂體反應非常重

3、要。另有報道顯示，TRPC1和TRPC3定位于小鼠精子鞭毛，推測TRPC1和TRPC3可能參與調節(jié)重要的鈣依賴性事件，包括頂體反應、精子活力及精子獲能。在人類精子中，TRPC1、3、4及6存在于精子頭部及鞭毛，而TRPC2被認為是假基因。 目的及意義: 目前有關TRPM和TRPV通道家族在大鼠睪丸和人精液生精細胞及精子中的表達及相關功能仍不十分清楚。有鑒于此，本研究采用RT-PCR技術分別檢測TRPM和TRPV通道家族m

4、RNA在大鼠睪丸及人精液生精細胞和精子中的表達情況，采用TRPV1通道特異性激動劑和阻滯劑作用于人精液精子并檢測其對精子線粒體呼吸鏈及膜電位的影響，探討TRPV1對精子線粒體功能的調節(jié)作用及相關分子機制。此外還檢測了氧化應激狀態(tài)下精子線粒體功能和各項運動參數(shù)的變化及凋亡相關蛋白的表達情況，采用TRPV1通道阻滯劑探討TRPV1在精子氧化應激中的作用及可能分子機制。本課題將為進一步研究TRP離子通道在精子發(fā)生中的作用提供理論依據(jù)，為研究弱

5、精子癥病因提供實驗依據(jù)，并為臨床發(fā)明新的節(jié)育技術和治療男子不育提供新的思路。 研究分四個部分： 第一部分、TRPV及TRPM離子通道家族在大鼠生精細胞中的表達。 目的：本研究探討TRPV及TRPM離子通道家族在大鼠生精細胞中的表達情況，采用RT-PCR技術檢測TRPV及TRPM mRNA的表達，蛋白印跡技術檢測TRPV及TRPM離子通道蛋白在大鼠生精細胞中的的表達，免疫組織化學技術檢測TRPV及TRPM離子通道蛋

6、白在大鼠生精細胞中的表達分布情況，并進一步證實大鼠生精細胞中存在TRPV及TRPM離子通道，為下一步功能研究及揭示男子不育相關發(fā)病機制奠定理論基礎。 方法：采用機械法分離大鼠生精細胞，非連續(xù)Percoll密度梯度離心法分離純化生精細胞，TRIzol法提取細胞總RNA，RT-PCR合成并擴增目的基因，瓊脂糖凝膠電泳檢測目的基因的存在，實時熒光定量RT-PCR技術檢測目的基因相對表達量。蛋白印跡技術檢測TRPV及TRPM離子通道蛋白

7、在大鼠生精細胞中的表達，免疫組織化學技術檢測TRPV及TRPM離子通道蛋白在大鼠生精細胞中的表達分布情況。 結論：大鼠生精細胞中存在多種TRPM及TRPV離子通道家族的表達，其中TRPM4及TRPM7 mRNA及蛋白在大鼠生精細胞中均呈相對較高表達。本研究結果將為研究生精細胞中TRP通道的功能及TRP通道各亞型之間的相互關系提供參考依據(jù)。 第二部分、TRPV及TRPM離子通道家族在人精液精子中的表達。 目的：本研

8、究探討TRPV及TRPM離子通道家族在人精液精子中的表達情況，采用RT-PCR技術檢測TRPV及TRPM mRNA的表達，蛋白印跡技術檢測TRPV及TRPM離子通道蛋白在人精液精子中的表達，免疫熒光技術檢測TRPV及TRPM離子通道蛋白在人精液精子中的表達分布情況，并進一步證實人精液精子中存在TRPV及TRPM離子通道，為下一步功能研究及揭示男子不育相關發(fā)病機制奠定理論基礎。 方法：采用非連續(xù)Percoll密度梯度離心法分離人精

9、液中精子，TRIzol法提取細胞總RNA，RT-PCR合成并擴增目的基因，瓊脂糖凝膠電泳檢測目的基因的存在。蛋白印跡技術檢測TRPV及TRPM離子通道蛋白在人精液精子中的表達，免疫熒光染色技術檢測TRPV及TRPM離子通道蛋白在人精液精子中的表達分布情況。 結論：人精液生精細胞及精子中存在多種TRPV家族離子通道的表達，其中TRPV1及TRPV2mRNA在人精液生精細胞及精子中呈相對較高表達。本研究結果將為研究人類生精細胞及精子

10、中TRP通道的功能及TRP通道各亞型之間的相互關系提供參考依據(jù)，并為進一步揭示TRP離子通道與精子運動的相互關系及特發(fā)性少弱精癥的分子機制奠定理論基礎。 第三部分、TRPV1對精子線粒體呼吸與能量代謝的影響。 目的：本研究探討TRPV1對精子線粒體氧化呼吸與能量代謝的影響。采用不同劑量的TRPV1配體作用于體外精子后，檢測精子線粒體膜電位、氧化呼吸功能及能量代謝的變化以及精子運動學參數(shù)的改變，試圖闡明TRPV1對精子線粒

11、體氧化呼吸功能及精子活力的影響，揭示TRPV1影響精子活力的可能作用機制，為進一步揭示男子不育相關發(fā)病機制奠定理論基礎。 方法：手淫法收集健康生育男性精液，采用上游法分離精液精子。每份精液等分為五份，分別接受不同的處理。實驗分五組，即四個實驗組和一個對照組。實驗組分別加入20μmmol/L capsaicin（B組）、50μmmol/L capsaicin（C組）、20μmmol/L capsazepine（D組）和50μmmo

12、l/L capsazepine（E組），對照組（A組）不加藥物。采用計算機輔助的精液分析（CASA）測定精子活率及運動參數(shù)，JC-1探針法檢測精子線粒體膜電位的變化，線粒體呼吸測定試劑盒測定精子線粒體呼吸氧耗速率，高效液相色譜法檢測精子線粒體內腺苷酸含量。 結論：TRPV1配體可能通過與TRPV1受體結合或者非受體途徑，作用于精子線粒體，降低線粒體呼吸氧耗，損害精子線粒體能量代謝，最終影響精子活力。本研究結果將為進一步研究特發(fā)性弱

13、精子癥病因提供實驗依據(jù)。 第四部分、TRPV1在精子氧化應激中的作用。 目的：本研究探討TRPV1在精子氧化應激中的作用，揭示氧化應激中精子凋亡的可能機制，為進一步功能研究及揭示男子不育相關發(fā)病機制奠定理論基礎。本研究應用次黃嘌呤-黃嘌呤氧化酶體系產(chǎn)生ROS，造成氧化應激損傷的體外實驗模型，分析ROS對精子運動功能及線粒體功能的影響，同時檢測凋亡相關蛋白的表達情況，通過阻斷TRPV1的作用，試圖揭示TRPV1參與精子氧化

14、應激過程誘導凋亡的可能分子機制。 方法：手淫法收集健康生育男性精液，Percoll梯度離心法分離精液精子，采用次黃嘌呤、黃嘌呤氧化酶制備精子氧化應激體外實驗模型。實驗分五組，A組，精子懸液；B組，精子懸液+次黃嘌呤（終濃度為1mmol/L）+黃嘌呤氧化酶（終濃度為50mU/ml）；C組，精子懸液+capsazepine（終濃度為1μmol/L）+次黃嘌呤（終濃度為1 mmol/L）+黃嘌呤氧化酶（終濃度為50 mU/ml）；D組

15、，精子懸液+CsA（終濃度為0.2 μmol/L）+次黃嘌呤（終濃度為1 mmol/L）+黃嘌呤氧化酶（終濃度為50 mU/ml）；E組，精子懸液+CsA（終濃度為0.2μmol/L）+capsazepine（終濃度為1μmol/L）+次黃嘌呤（終濃度為1 mmol/L）+黃嘌呤氧化酶（終濃度為50mU/ml）。采用計算機輔助的精液分析（CASA）測定精子活率及運動參數(shù)，JC-1探針法檢測精子線粒體膜電位的變化，F(xiàn)ITC-Annexin

16、 Ⅴ探針法檢測精子凋亡，蛋白印跡法檢測細胞色素c表達，分光光度法檢測Caspase3、9的活性。 結論：在精子氧化應激反應中，TRPV1可能通過調控細胞內鈣離子濃度，誘發(fā)線粒體通透性轉換孔開放，導致細胞色素C釋放于胞漿，激活caspase-9和3，從而參與誘導經(jīng)線粒體途徑的精子凋亡。阻斷TRPV1的作用有助于減輕氧化應激反應所致精子凋亡。 總結： 1.大鼠及人生精細胞和精子中存在多種TRPV及TRPM離子通道的表

17、達。 2.人精液生精細胞及精子中均存在TRPV1離子通道的表達，主要定位于精子頭部，可能與精子頂體反應、獲能及精卵結合等有關。 3.TRPV1可能通過調節(jié)精子胞漿內離子濃度的變化，改變線粒體膜電位，影響線粒體氧化呼吸功能及能量代謝，從而參與精子運動調控。 4.在精子氧化應激反應中，TRPV1可能通過調控細胞內鈣離子濃度，降低線粒體膜電位，誘發(fā)線粒體通透性轉換孔開放，導致細胞色素C釋放于胞漿，激活caspase-9