離子通道TRPM7調節(jié)細胞生理的分子機制研究.pdf

1、心腦血管疾病已然成為引起人類死亡的首要原因，深入了解心腦血管疾病的發(fā)病機制，開發(fā)有效的治療藥物已經(jīng)迫不及待。離子通道在心腦血管疾病發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮了重要的作用。最近，短暫性受體電位（TRP）離子通道在心腦血管系統(tǒng)生理病理中的作用引起了人們的廣泛關注。至今發(fā)現(xiàn)的30多種TRP通道絕大多數(shù)表達在中樞神經(jīng)系統(tǒng)，其中至少有19種也在內皮細胞中所有表達。TRPM7作為TRP通道m(xù)elastatin家族的第7號成員，因為結構特殊、表達廣泛、功能眾多而

2、受到關注。首先，TRPM7除了具有離子通道結構域，在其C末端含有一個激酶結構域，又被稱為通道酶。TRPM7的活性受到多種因素的調節(jié)包括自身蛋白的磷酸化、胞內的磷脂酰肌醇-4，5-二磷酸(PIP2)、pH值、氧化應激、機械應力、血管活性物質等，暗示其生物功能的多樣性。其次，TRPM7廣泛分布于各種組織和器官，包括心臟、大腦、肺、肝臟、血管等等。再次，TRPM7調節(jié)各種各樣的生理病理過程，例如調節(jié)細胞的增值、遷移、粘附、凋亡、炎癥反應、離子

3、平衡等。越來越多的證據(jù)顯示TRPM7在腦組織和心血管系統(tǒng)的生理病理過程中發(fā)揮了非常重要的調節(jié)作用，參與調節(jié)腦卒中、高血壓、心房顫動、心臟的早期發(fā)育、血管內皮細胞的增殖遷移、平滑肌細胞的增殖和鎂離子穩(wěn)態(tài)等。例如，腦缺血或氧糖剝奪(OGD)產(chǎn)生的超氧陰離子可以激活TRPM7，導致神經(jīng)元細胞的鈣離子內流增加，增加神經(jīng)元細胞的損傷，而抑制TRPM7的活性或干擾其表達都能顯著抑制神經(jīng)元細胞的鈣離子內流和損傷。血管內皮細胞和星形膠質細胞分別作為心血

4、管系統(tǒng)和中樞神經(jīng)系統(tǒng)中重要的組成部分，發(fā)揮了重要的生理和病理功能。血管內皮細胞是指血管內膜表面的一層細胞，主要參與血管的收縮和舒張、凝血、動脈硬化、血管生成以及炎癥等生理病理過程。之前的研究發(fā)現(xiàn)，干擾TRPM7在人臍靜脈內皮細胞中的表達增加了細胞的增殖和遷移，保護了高糖誘導的內皮損傷。暗示TRPM7在血管內皮中扮演重要角色。而星形膠質細胞是中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的數(shù)量最多的細胞，是神經(jīng)元細胞的6-10倍。星形膠質細胞的偽足既可以延伸入到神經(jīng)細胞

5、周圍，發(fā)揮其支持和滋養(yǎng)神經(jīng)元、分泌和吸收神經(jīng)遞質、調節(jié)離子平衡以及參與免疫反應等作用，又可以附著在鄰近的毛細血管壁上，調節(jié)血管張力和血腦屏障。TRPM7在大腦中的表達較高，又參與了腦缺血誘導的神經(jīng)元損傷，但在星形膠質細胞中的作用還不是很清楚，所以本項目通過研究TRPM7調節(jié)細胞生理的分子機制來完成以下幾個目的。
　　目的：①以人臍靜脈內皮細胞(HUVEC)為血管內皮模型，通過研究TRPM7對的血管內皮細胞的形態(tài)、粘附、遷移、體外血

6、管新生等生理過程的影響及其分子機制來探討TRPM7對血管內皮功能調節(jié)作用，為TRPM7作為治療心腦血管疾病藥物靶點的提供可靠的實驗依據(jù)。②通過研究功能性的離子通道TRPM7在星形膠質細胞中的表達、對細胞增殖和遷移的影響及其分子機制，探討TRPM7對大腦膠質細胞功能的調節(jié)，為治療中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病的提供潛在的新藥物靶點。
　　方法：⑴利用小干擾RNA(siRNA)特異性地干擾HUVEC中TRPM7通道m(xù)RNA和蛋白的表達，通過實時定量

7、聚合酶鏈式反應(quantitative real time-PCR，qPCR)和電生理的方法來驗證siRNA的干擾效率。⑵觀察和定量分析干擾TRPM7表達后HUVEC的形態(tài)變化及其對細胞外基質(matrigel)的粘附能力的變化。⑶利用遷移小室(transwell)和劃痕實驗研究干擾TRPM7表達后HUVEC與正常對照細胞間遷移能力變化。⑷通過內皮細胞在matrigel上形成血管樣結構來分析干擾TRPM7表達之后對HUVEC體外血管生

8、成的影響。⑸通過免疫蛋白印跡或者qPCR的方法研究干擾TRPM7表達后的HUVEC的 MEK1/2和肌球蛋白輕鏈(MLC)分子的磷酸化水平，以及其他鈣離子調節(jié)相關基因如Orai1、Stim1、TRPC3和TRPC1的表達。⑹利用逆轉錄聚合酶鏈式反應(RT-PCR)、免疫蛋白印跡和電生理的方法檢測功能性TRPM7通道在星形膠質細胞中的表達。⑺利用特異性的siRNA降低TRPM7在星形膠質細胞中的表達，然后通過RT-PCR，qPCR、免疫蛋

9、白印跡和電生理的方法來驗證siRNA的干擾效率以及TRPM7通道功能的抑制。⑻通過檢測細胞內乳酸脫氫酶(LDH)含量和細胞劃痕實驗分別來研究TRPM7在星形膠質細胞增殖和遷移中的作用。⑼利用免疫蛋白印跡方法，研究TRPM7調節(jié)星形膠質細胞增殖和遷移過程的分子機制。⑽利用鎂離子濃度試劑盒和流式細胞術研究TRPM7對星形膠質細胞內鈣離子和鎂離子濃度的影響。⑾通過細胞增殖實驗研究胞外的鈣、鎂離子對TRPM7調節(jié)的星形膠質細胞增殖的影響。

10、>　　結果：⑴qPCR的結果顯示，轉染TRPM7 siRNA-1和siRNA-272小時后HUVEC的TRPM7 mRNA的表達水平分別下降到了～39.67％和～29.49％。電生理實驗全細胞膜片鉗的結果也顯示HUVEC細胞膜上的TRPM7樣的電流密度也顯著性地降低了，當細胞膜的電壓鉗制在-80 mv時TRPM7電流密度下降了～63.8％，當鉗制在+80 mv時下降了～45.5％。同時，對HUVEC胞內鎂離子檢測發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，干擾

11、TRPM7后鎂離子濃度顯著下降～10％。提示siRNA有效的干擾了HUVEC中TRPM7的表達和功能。⑵干擾TRPM7表達后HUVEC的形態(tài)發(fā)生明顯變化（從扁平多角形狀變成細長狀）。對單細胞平均表面積進行統(tǒng)計分析，結果顯示干擾TRPM7后單細胞的平均表面積降低了～50％。隨后粘附實驗結果顯示，HUVEC對細胞外基質的粘附能力也顯著下降了～45.67％。⑶Tranwell實驗和劃痕實驗的結果顯示，干擾TRPM7表達后的HUVEC，與對照組

12、相比，遷移能力和損傷修復能力分別增加了～300％和～56.64％，而且HUVEC早期（4小時）體外血管生成能力也增加了～39.5％。⑷分子機制研究發(fā)現(xiàn)，干擾TRPM7表達后，HUVEC的MEK和MLC的磷酸化水平明顯增加，而使用MEK的特異性抑制劑U0126后，干擾TRPM7誘導的MLC磷酸化水平與對照組沒有差異。同時，U0126也能夠顯著性的抑制TRPM7調節(jié)的HUVEC的形態(tài)變化以及細胞遷移增加。提示TRPM7調節(jié)HUVEC的生理過

13、程可能是通過MEK/ERK/MLC信號通路。⑸qPCR和免疫蛋白印跡實驗結果顯示，轉染TRPM7 siRNA后并不影響HUVEC的TRPC3、Orai1、Stim1基因的表達，但顯著性地上調了TRPC1的mRNA和蛋白表達。⑹體外成功分離和培養(yǎng)了小鼠大腦皮層原代星形膠質細胞，經(jīng)細胞免疫熒光實驗鑒定純度高達95％以上。⑺RT-PCR和細胞免疫熒光實驗結果顯示星形膠質細胞表達TRPM7的mRNA和蛋白。同時，利用全細胞膜片鉗技術檢測到星形膠

14、質細胞膜表面表達TRPM7樣的電流。⑻轉染TRPM7 siRNA-1和siRNA-2都能夠顯著性地降低星形膠質細胞中的TRPM7 mRNA和蛋白的表達，而不影響TRPM4和TRPM6的mRNA表達。進一步實驗顯示TRPM7 siRNA-1能顯著性地降低TRPM7的mRNA表達和電流密度。⑼干擾TRPM7的表達或抑制TRPM7的活性導致星形膠質細胞的增殖和遷移能力顯著下降。免疫蛋白印跡實驗結果顯示，干擾TRPM7的表達導致星形膠質細胞MA

15、PK信號通路中的ERK1/2和JNK分子的磷酸化水平分別下降了～24.37％和～36.64％，而p38和Akt的磷酸化水平?jīng)]有變化。同時，TRPM7的抑制劑2-APB也抑制了星形膠質細胞ERK和JNK的磷酸化水平。⑽MEK和JNK信號通路的選擇性抑制劑U0126和SP600125分別都顯著性地抑制了星形膠質細胞增殖和遷移。暗示TRPM7調節(jié)星形膠質細胞的增殖和遷移是通過ERK和JNK信號通路。⑾在四環(huán)素誘導的過表達TRPM7的HEK29

16、3細胞中胞內的鎂離子濃度顯著增加了～73.2％，而干擾TRPM7表達后星形膠質細胞內的鎂離子濃度顯著下降了～43.5％，但流式細胞術的實驗結果顯示鈣離子水平并沒有受到影響。但是細胞外添加鎂離子并不能挽救干擾TRPM7表達導致的細胞增殖抑制。
　　結論：①TRPM7在人臍靜脈內皮細胞中總體上呈現(xiàn)出一種負調控作用，特異性的干擾TRPM7表達改變了細胞的形態(tài)，促進細胞的遷移和早期血管生成，上調TRPC1的表達，有利于保護內皮的部分功能，

17、這一過程可能受到MEK/ERK/MLC信號通路的調節(jié)。TRPM7可能成為一個新的調節(jié)內皮細胞生理功能的藥物靶點。②星形膠質細胞表達功能性的TRPM7通道，干擾TRPM7表達或抑制其活性損傷ERK和JNK信號通路的活化，抑制星形膠質細胞的增殖和遷移。雖然TRPM7可以調節(jié)星形膠質細胞內的鎂離子濃度，但細胞外添加鎂離子并不影響星形膠質細胞的增殖，也無法挽救干擾TRPM7導致的細胞增殖抑制。TRPM7可能成為一個新的調節(jié)星形膠質細胞的生理功能