垂體特異轉(zhuǎn)錄因子-1在生長(zhǎng)激素腺瘤生物學(xué)行為中作用的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、第一部分 pit-1、c-myc基因在垂體生長(zhǎng)激素腺瘤中表達(dá)的生物學(xué)意義 目的： 1、觀察垂體特異轉(zhuǎn)錄因子Pit-1、C-myc基因在垂體生長(zhǎng)激素腺瘤中的表達(dá)。 2、研究pit-1基因、c-myc基因與垂體生長(zhǎng)激素腺瘤GH水平的關(guān)系，并分析其相關(guān)性。 3、探討pit-1基因、c-myc基因在垂體生長(zhǎng)激素腺瘤發(fā)病機(jī)制中可能的作用。 方法： 用免疫組織化學(xué)鏈霉親和素-生物素-過氧化物酶

2、復(fù)合物法(SABC)和圖像分析技術(shù)測(cè)定Pit-1蛋白、C-myc蛋白在垂體生長(zhǎng)激素腺瘤中的表達(dá)。 結(jié)果： 1、Pit-1蛋白在全部的GH腺瘤中均有高表達(dá)，與對(duì)照組相比，有顯著性差異(P＜0.01)。GH瘤組中pit-1的表達(dá)量與其術(shù)前的激素水平呈顯著正相關(guān)(r=0.966)。 2、C-myc蛋白在26例GH腺瘤中有19例表達(dá)，表達(dá)率為73.1％，正常垂體組織中未見表達(dá)，二者比較有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.01)。C

3、-myc的表達(dá)與激素水平呈相關(guān)性。 結(jié)論： 1.pit-1基因在所有生長(zhǎng)激素腺瘤中均高表達(dá)，其表達(dá)與GH水平、腫瘤的侵襲性呈正相關(guān)，在GH腺瘤發(fā)病機(jī)制中起重要作用。 2.c-myc基因在絕大多數(shù)GH腺瘤中有表達(dá)，其表達(dá)與GH水平、腫瘤的侵襲性呈正相關(guān)，在垂體生長(zhǎng)激素腺瘤細(xì)胞增殖、腫瘤的侵襲性方面發(fā)揮重要作用。 第二部分 抑制pit-1對(duì)GH腺瘤細(xì)胞生物學(xué)行為的影響 目的： 1、觀察

4、pit-1-AODN對(duì)生長(zhǎng)激素腺瘤細(xì)胞增殖、激素水平的影響； 2、觀察pit-1-AODN對(duì)GH腺瘤細(xì)胞凋亡及細(xì)胞周期的影響。 3、觀察pit-1-AODN對(duì)GH腺瘤細(xì)胞中Pit-1、pit-1-mRNA和C-myc、c-mycmRNA的表達(dá)調(diào)控。 4、探討pit-1基因與c-myc基因的相關(guān)關(guān)系及pit-1-AODN抑制GH腺瘤細(xì)胞增殖、激素水平及誘導(dǎo)瘤細(xì)胞凋亡和改變細(xì)胞周期的作用機(jī)制。 方法：

5、 1、以脂質(zhì)體為載體包裹pit-1-AODN，制成能進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的pit-1“反義基因封條”；以pit-1正義寡核苷酸(SODN)為對(duì)照。 2、用MTT法測(cè)定pit-1-AODN對(duì)GH腺瘤細(xì)胞增殖的影響。 3、RIA法測(cè)定Pit-1ODN對(duì)GH腺瘤細(xì)胞分泌生長(zhǎng)激素的影響。 4、用流式細(xì)胞儀(FCM)檢測(cè)細(xì)胞凋亡和細(xì)胞周期的改變。 5、免疫細(xì)胞化學(xué)方法測(cè)定pit-1-AODN對(duì)GH腺瘤細(xì)胞中pit-1、c-m

6、yc蛋白表達(dá)的變化。 6、用RT-PCR法檢測(cè)干預(yù)前后pit-1mRNA、c-mycmRNA表達(dá)的變化。 結(jié)果： 1、pit-1-AODN在一定的時(shí)間、濃度范圍內(nèi)，呈劑量、時(shí)間依賴性方式抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)，正義組、對(duì)照組無(wú)此作用。 2、pit-1-AODN對(duì)腫瘤細(xì)胞分泌GH激素水平的抑制作用表現(xiàn)出時(shí)間和劑量依賴性。20μmol/L組在24、48、72h時(shí)對(duì)GH水平的抑制率分別是9.23％、23.1％、46.

7、0％，各組間相比較，有顯著性差異(各P＜0.05)，96h組與72h組間比較，無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)，120h組與各組比較，各P＜0.01。 3、不同濃度的AODN作用于GH腺瘤細(xì)胞48h后，均顯示出亞G1峰(為凋亡峰)，AODN呈劑量依賴性非線性方式誘導(dǎo)其凋亡，且呈濃度依賴性改變細(xì)胞周期的分布，在一定濃度范圍內(nèi)，隨濃度的增加，G2/M細(xì)胞比例增加。 4、在12例組織標(biāo)本中，全部有pit-1、pit-1mRNA的表

8、達(dá)，經(jīng)pit-1AODN(20μM、40μM組)處理后，10例pit的表達(dá)均明顯下降；9例有C-myc、c-mycmRNA的表達(dá)，經(jīng)pit-1AODN處理后，7例C-myc、c-mycmRNA的表達(dá)均明顯下降，2例表達(dá)下降不明顯。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析表明，Pit-1、pit-1mRNA和C-myc、c-mycmRNA在干預(yù)前后的表達(dá)有顯著性差異(P＜0.05)。 結(jié)論： 1、Pit-1AODN對(duì)GH腺瘤細(xì)胞的增殖、GH水平有較強(qiáng)的

9、抑制作用。 2、Pit-1AODN夠明顯抑制GH腺瘤細(xì)胞pit-1、pit-1mRNA和C-myc、c-mycmRNA的表達(dá)。 第三部分 pit-1反義寡核苷酸對(duì)奧曲肽治療GH腺瘤作用影響的實(shí)驗(yàn)研究 目的： 1、觀察pit-1反義寡核苷酸對(duì)奧曲肽抑制GH腺瘤細(xì)胞作用的影響。 2、與奧曲肽對(duì)照研究，評(píng)價(jià)Pit-1AODN治療垂體GH腺瘤的應(yīng)用效果和前景，為以pit-1為靶點(diǎn)治療垂體GH腺瘤的

10、應(yīng)用提供理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。 方法： 1、MTT法測(cè)定pit-1AODN對(duì)Octreotide抑制GH瘤細(xì)胞增殖抑制的影響。 2、RIA法測(cè)定pit-1AODN對(duì)Octreotide抑制細(xì)胞培養(yǎng)液GH水平的影響。 3、FCM測(cè)定pit-1AODN對(duì)Octreotide誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡及細(xì)胞周期改變的影響。 4、Westernblot法測(cè)定pit-1AODN和Octreotide對(duì)GH腺瘤細(xì)胞中pit-1、

11、c-myc蛋白表達(dá)的影響。 5、Boyden小室體外侵襲試驗(yàn)，比較pit-1AODN和Octreotide對(duì)GH腺瘤細(xì)胞侵襲力的影響。 結(jié)果： 1、在96、120h時(shí)，pit-1AODN與Octreotide兩組間比較，對(duì)GH腺瘤細(xì)胞增長(zhǎng)抑制有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05)，余時(shí)間點(diǎn)兩組間無(wú)差異。二者聯(lián)合應(yīng)用時(shí)，Octreotide對(duì)pit-1AODN的作用有協(xié)同作用。 2、48h時(shí)，pit-1AODN組與O

12、ctreotide組相比，GH水平顯著下降，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05)，余時(shí)間點(diǎn)二者間無(wú)差異。D組GH水平明顯受抑制，與B、C及對(duì)照組相比，有高度顯著性差異(P＜0.01)； 3、AODN組在一定范圍內(nèi)，隨時(shí)間的增加，G2/M細(xì)胞比例增加。在Octreotide組，G0/G1期細(xì)胞比例增加，S期細(xì)胞比例減少，有時(shí)間依賴性。D組誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的作用明顯優(yōu)于B、C組，具有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P均＜0.05)。 4、pit-1A

13、ODN較Octreotide對(duì)pit-1、c-myc蛋白的表達(dá)有明顯的抑制作用。 5、pit-1AODN較Octreotide能降低GH腺瘤細(xì)胞的侵襲能力。 結(jié)論： 1、pit-1AODN與Octreotide均能顯著抑制GH腺瘤的增殖、GH水平，但pit-1AODN出現(xiàn)抑制時(shí)間早，效果好。 2、pit-1AODN與Octreotide通過不同的途徑均能促進(jìn)細(xì)胞凋亡、改變細(xì)胞周期，二者均有較好的協(xié)同作用。