空間距離在胸腺基質細胞培訓胸腺細胞中的關鍵作用.pdf

1、背景及目的：胸腺是培訓胸腺細胞發(fā)育的首要場所，來源于骨髓的前T細胞進入胸腺環(huán)境中，從胸腺被膜下區(qū)，經胸腺皮質向皮質皮髓交界區(qū)、髓質移動，經一系列復雜的培訓過程，包括增殖、受體基因重排、MHC限制的陽性選擇、排除自身反應性和缺陷細胞的陰性選擇、細胞表面分子和功能上的成熟等，確保了外周成熟T細胞可識別外源性抗原肽和自身MHC復合物(自身MHC限制性)，并消除自身反應性T細胞(自身耐受)。這個過程中每一步都是在胸腺的微環(huán)境中進行，胸腺微環(huán)境主

2、要由胸腺基質細胞和細胞外基質組成，其中胸腺基質細胞是胸腺微環(huán)境中最重要的成分。胸腺基質細胞在胸腺中以三維立體構成網狀支架結構，胸腺細胞與基質細胞在不同區(qū)域的相互作用對精密有序地完成了陽性選擇和陰性選擇起重要的作用。胸腺基質細胞在空間、時間上為胸腺細胞的培訓提供了最適合的微環(huán)境，對胸腺細胞分化以及功能性亞群的形成有決定性的作用。 胸腺不僅在建立和塑造有功能的T細胞庫中發(fā)揮作用，而且對誘導和維持自身耐受和移植耐受起關鍵作用。經胸腺途

3、徑誘導免疫耐受已進行了廣泛研究，主要的機理是通過胸腺的選擇作用，消除自身、同種、異種供體反應性T細胞，從而達到較穩(wěn)定的免疫耐受。最近發(fā)現(xiàn)在胸腺基質細胞廣泛地表達外周組織器官的組織特異性抗原，所以胸腺基質細胞被認為是外周組織器官的自身抗原庫的鏡子，在自身耐受和維持免疫自身穩(wěn)定起著關鍵性作用。異種胸腺移植不僅可以重建有功能的細胞免疫功能，而且可以誘導供者特異性免疫耐受，但其面臨的主要問題是宿主T細胞在異種胸腺內成熟后不能產生對宿主抗原足夠的

4、自身耐受，而發(fā)生了多器官的自身免疫損害，如甲狀腺炎、淚腺炎、卵巢炎以及胃炎等，而同系或同種胸腺移植的受者未發(fā)生自身免疫綜合征。我們以前將同系胸腺與異種胸腺充分混后再進行移植，既能誘導供體特異性的免疫耐受，又能防止自身免疫損害的發(fā)生。然而胸腺細胞在混合胸腺中是如何被訓練的并不清楚；也不知道從骨髓來源的前T細胞進入混合胸腺后，是一個克隆的T細胞經歷混合胸腺中的一個胸腺培訓，還是要經歷兩個不同胸腺的共同培訓?因此我們設計了將不同種類的兩種胸腺

5、分別移植在一個機體內的不同部位，并進行T細胞示蹤實驗，以闡明T細胞在成熟、分化過程中是一個連續(xù)不斷的培訓，還是在經過一個胸腺培訓后進入外周，并能再次到另一處胸腺進行第二次培訓?這些基本問題對我們理解T細胞發(fā)育和T細胞“再教育”具有重要意義。 方法 1.將不同類型胎胸腺移植到裸小鼠雙腎包膜下，建立胸腺基質細胞培訓T細胞的實驗模型。實驗分組：DB組(同系胸腺移植組，雙腎包膜下移植BalB/C胎胸腺)；DC組(同種胸腺移植組，

6、雙腎包膜下移植C57BL/6胎胸腺)；DF組(異種胸腺移植組，雙腎包膜下移植F344胎胸腺)；DBF組(同系異種胸腺混合移植組，雙腎包膜下移植BalB/C+F344的混合胎胸腺)；DCF組(同種異種胸腺混合移植組，雙腎包膜下移植C57BL/6+F344的混合胎胸腺)；LBRF組(同系、異種胸腺分開移植組，左腎包膜下移植BalB/C胎胸腺，右腎包膜下移植F344胎胸腺)；LCRF組(同種、異種胸腺分開移植組，左腎包膜下移植C57BL/6胎

7、胸腺，右腎包膜下移植F344胎胸腺)。 2.利用流式細胞儀檢測了胸腺移植4月后裸小鼠外周血中CD3+CD4+，CD3+CD8+，CD4+CD25+T細胞，了解胸腺移植后受者裸小鼠T細胞的重建情況。 3.胸腺移植6月后裸小鼠受體的脾細胞體外進行ConA刺激和單向混合淋巴細胞反應，了解胸腺移植后裸小鼠受體重建T細胞的免疫功能。 4.觀察移植胸腺存活情況與胸腺的體積大，利用組織學和免疫組織化學技術觀察移植胸腺的結構以及

8、受者骨髓源細胞在胸腺移植物內的分布情況。 5.胸腺移植4月后，裸小鼠受體進行皮膚移植實驗，將正常BalB/C小鼠、C57BL/6小鼠、F344大鼠及SD大鼠的皮膚同時移植在受體裸小鼠背部，觀測其皮膚移植物的存活情況。 6.用間接熒光染色的方法檢測實驗動物血清中有無針對宿主胃組織的自身抗體，用ELISA法測血清中抗DNA抗體，并記錄各組動物因自身免疫性病疾的死亡率。 7.用51Cr同位素標記同系胸腺移植組和異種胸腺

9、移植組的T細胞，分別再輸注于LBRF組，48h和5d后，活殺實驗動物，取各臟器進行同位素CPM測定，了解經一個胸腺發(fā)育成熟的T細胞是否可以再循環(huán)到另一個胸腺中進行再培訓。 結果 1.各組胸腺移植物均存活良好，DB組、DC組、DF組、DBF組及DCF組兩側胸腺體積大小沒有明顯的差異，而LBRF組，右側的異種F344胸腺顯著較左側的同系BALB/c胸腺體積小，LCRF組雖然兩側胸腺體積上沒有明顯差別，但較DB組、DC組、DF

10、組、DBF組及DCF組的胸腺體積小。HE染色發(fā)現(xiàn)，移植胸腺具有正常的皮質和髓質結構。免疫組化染色顯示，單純異種胎胸腺移植中含有宿主MHCⅡ類抗原陽性細胞，主要位于髓質中，具有典型樹突樣外觀。 2.各組胸腺移植后均能夠有效重建受者裸小鼠外周血中的CD4+T，但外周血中CD3+CD8+T細胞明顯低于免疫健全BALB/c小鼠，CD4+CD25+T細胞DB組、DF組、LBRF組比正常BALB/c小鼠低(P＜0.05)，其余各組與正常BA

11、LB/c小鼠沒有顯著差異。 3.各組胸腺移植后受者脾細胞對ConA及無關來源的SD鼠脾細胞刺激的應答均較強，而對自身BALB/c脾細胞刺激無顯著反應，DC組、DF組、DBF組、DCF組分別對相應胸腺供者來源的C57BL/6、F344、BALB/c與F344、C57BL/6與F344的脾細胞沒有增殖反應，而LBRF組、LCRF組分別對相應胸腺供者來源的脾細胞仍有反應。 4.皮膚移植實驗顯示，DB組：除對BalB/C皮膚不排

12、斥外，對其它皮膚均排斥；DC組對宿主BalB/C皮膚和胸腺供者來源的C57BL/6皮膚耐受，而對無關的F344及SD皮膚排斥；DF組與DBF組對宿主BalB/C皮膚及胸腺供者來源的F344皮膚耐受，而對無關的C57BL/6皮膚及SD皮膚排斥；DCF組對宿主BalB/C皮膚及胸腺供者來源的F344、C57BL/6皮膚耐受，而對無關的SD皮膚排斥；LBRF組只對宿主BalB/C皮膚耐受，而對胸腺供者來源的F344皮膚延遲排斥，對無關的C57

13、BL/6皮膚及SD皮膚排斥；LCRF組只對宿主BalB/C皮膚耐受，而對胸腺供者來源的F344及C57BL/6皮膚延遲排斥，對無關的SD皮膚排斥。 5.單純異種胸腺組(DF組)因自身免疫性病疾死亡率最高(70％)，其次是不同種類胸腺在不同部位分開移植的LBRF組(45.5％)與LCRF組(33.3％)。各組的腎臟、肝臟、心臟以及肺臟等器官均未發(fā)現(xiàn)明顯的病理改變和淋巴細胞浸潤。但DF組、LBRF組及LCRF組胃組織有炎癥性損傷和淋

14、巴細胞浸潤，其它組胃組織均未見明顯的炎性損害和淋巴細胞浸潤。DF組、LBRF組、LCRF組血清中有針對宿主胃組織的自身抗體和抗DNA抗體的相對滴度顯著增高，提示DF組、LBRF組、LCRF組有自身免疫性損害。 6.標記51Cr的同系胸腺發(fā)育和異種胸腺發(fā)育的T細胞，分別再輸注于同系、異種胸腺分開移植的LBRF組后，48h和5d后，主要分布在肝脾部位，也在兩種不同胸腺中分布，按每g組織內含的51Cr標記T細胞時發(fā)現(xiàn)，最高的是胸腺，其

15、次是脾臟與肝臟。 結論 1.實驗成功建立了不同類型胸腺移植模型，通過胸腺移植可有效重建受者裸小鼠功能性胸腺細胞。 2.同系或同種胸腺與異種胸腺混合移植可誘導胸腺供者來源的免疫耐受，不發(fā)生自身免疫性疾??；而同系或同種胸腺與異種胸腺分開移植于同一裸鼠的不同部位后不能誘導對供者來源的移植物完全耐受，也不能防止自身免疫性疾病的發(fā)生，說明空間距離在胸腺基質細胞培訓胸腺細胞中起關鍵作用。 3.胸腺混合移植誘導受者對供

16、者的完全耐受表明，一個克隆的T細胞肯定是在一次的程序化培訓中同時經兩種胸腺共同培訓或經提呈有另一個胸腺組織抗原的胸腺基質細胞的培訓；胸腺分開移植誘導受者對供者的不完全耐受，表明從一個胸腺發(fā)育的T細胞只有部分會再經過另一個胸腺的培訓。 4.經一種胸腺培訓的外周成熟T細胞可以返回自身的胸腺，也可以返回另一種胸腺中進行再培訓，返回胸腺的成熟T細胞可能增強陰性選擇，可能與免疫耐受有關。胸腺基質細胞對未成熟的前T細胞培訓比對成熟T細胞的培