鵝脫氧膽酸衍生物HS-1200阻抑肝癌的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、研究背景與目的： 原發(fā)性肝癌是我國最常見的惡性腫瘤之一，目前肝癌的治療仍以手術(shù)切除為首選的治療方法，但手術(shù)切除的突出問題是手術(shù)后復(fù)發(fā)率高，手術(shù)切除機(jī)會(huì)少，加上絕大多數(shù)患者在確診時(shí)已屬臨床中晚期，從而失去了手術(shù)治療的最佳時(shí)機(jī)。因此，科技工作者不斷研究一些新的療法，或者采取多種療法聯(lián)合的綜合治療來提高肝癌的總體療效。在各種治療方法中，肝癌的化療在肝癌的治療中占有重要地位。雖然肝癌不屬于化療敏感的惡性腫瘤，但由于化療途徑和化療方案的改

2、進(jìn)，肝癌化療的療效有了明顯的提高，成為肝癌綜合治療中的重要手段。因而研究和發(fā)現(xiàn)新的、有效的治療肝癌藥物是當(dāng)務(wù)之急。 膽汁酸是膽固醇的極性衍生物，主要有助于飲食中脂質(zhì)的吸收，并能調(diào)節(jié)控制膽固醇體內(nèi)平衡的相關(guān)基因的表達(dá)。由于化學(xué)結(jié)構(gòu)的不同，不同膽汁酸表現(xiàn)為不同的生物學(xué)特性，鵝脫氧膽酸為一種初級(jí)膽汁酸，可用來治療膽石癥并能控制血液中膽固醇濃度。近來研究表明鵝脫氧膽酸衍生物N-((3 α，5 β，7α )-3,7-二羥基-24-氧代膽甾

3、烷－24－基)　β－丙氨酸芐酯和N-((3α，5 β，7α )-3,7-二羥基－24－氧代膽甾烷-24－基)L－苯丙氨酸芐酯(HS－1199)能誘導(dǎo)多種癌細(xì)胞凋亡并能抑制其增殖，如人乳腺癌細(xì)胞、人子宮頸癌細(xì)胞，人前列腺癌細(xì)胞及人骨肉瘤細(xì)胞等，而以HS－1200作用更強(qiáng)。但還沒有關(guān)于HS－1200對(duì)肝腫瘤細(xì)胞的作用及機(jī)制的報(bào)道，在該實(shí)驗(yàn)中，我們探討鵝脫氧膽酸衍生物HS－1200誘導(dǎo)肝腫瘤細(xì)胞凋亡及抑制腫瘤細(xì)胞活性方面的作用及機(jī)制；并進(jìn)一步

4、用肝腫瘤細(xì)胞株BEL7402建立裸鼠人肝癌移植瘤模型，用HS－1200對(duì)荷瘤裸鼠進(jìn)行干預(yù)，并進(jìn)一步研究該藥物治療肝移植瘤的作用及作用機(jī)制。 方法： 1、培養(yǎng)肝腫瘤細(xì)胞株BEL7402及正常人肝細(xì)胞株L－02，分別用不同濃度的鵝脫氧膽酸衍生物HS-1200處理上述兩種細(xì)胞后，采用四氮唑藍(lán)法檢測鵝脫氧膽酸衍生物HS-1200對(duì)BEL7402及L-02細(xì)胞的細(xì)胞活性抑制作用；以DNA凝膠電泳法、流式細(xì)胞術(shù)檢測HS-1200誘導(dǎo)

5、細(xì)胞凋亡的作用并對(duì)細(xì)胞凋亡進(jìn)行量化；通過Hoechst33258染色熒光顯微鏡下觀察經(jīng)HS-1200處理后細(xì)胞形態(tài)的改變；為進(jìn)一步研究HS-1200誘導(dǎo)肝腫瘤細(xì)胞株凋亡的機(jī)制，我們應(yīng)用Western-blot檢測Bcl-2、Bax、cytochrome c、caspase-3、caspase-8、caspase-9及PARP的表達(dá)；為研究caspase-8及caspase-9在HS-1200誘導(dǎo)肝腫瘤細(xì)胞凋亡中的作用，應(yīng)用caspase

6、-8特異性抑制劑z-IETDfmk及caspase-9的特異性抑制劑z-LEHDfmk來阻斷caspase-8及caspase-9的活性，驗(yàn)證caspase-8及caspase-9在HS-1200誘導(dǎo)肝腫瘤細(xì)胞凋亡中的作用；大量的研究表明線粒體與細(xì)胞凋亡密切相關(guān)，其中線粒體跨膜電位的破壞，被認(rèn)為是細(xì)胞凋亡級(jí)聯(lián)反應(yīng)過程中最早發(fā)生的事件之一，一旦線粒體跨膜電位崩潰，則細(xì)胞凋亡不可逆轉(zhuǎn)，我們通過檢測線粒體跨膜電位的變化來驗(yàn)證線粒體在HS-12

7、00誘導(dǎo)肝腫瘤細(xì)胞凋亡中的作用。 2、荷瘤裸鼠動(dòng)物模型的構(gòu)建及鵝脫氧膽酸衍生物HS-1200對(duì)動(dòng)物模型的干預(yù)： BEL7402細(xì)胞培養(yǎng)于37℃、5％CO2的孵箱內(nèi)，培養(yǎng)基為含有10％FBS的DMEM，以0.25％的胰酶消化傳代，制備單細(xì)胞懸液，以臺(tái)盼蘭染色法計(jì)數(shù)活細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度為5×106/ml，無菌條件下接種至裸鼠的左肋部皮下，每個(gè)裸鼠接種部位一致且都接種0.2ml，接種后裸鼠在無菌、恒溫、恒濕的條件下飼養(yǎng)，待裸鼠肝移植瘤

8、生長至直徑5mm左右時(shí)，采用隨機(jī)數(shù)字法將裸鼠分為A、B、C、D 4組，采用腹腔注射的方法給藥，分別注射0.2ml生理鹽水(A組)，20mg/kgHS-1200(B組)，40mg/kg HS-1200(C組)，60mg/kg HS-1200(D組)，每日給藥1次，共5次。測量腫瘤的體積，繪制各組腫瘤的生長曲線，計(jì)算抑瘤率，實(shí)驗(yàn)結(jié)束后處死動(dòng)物，對(duì)移植瘤組織進(jìn)行HE染色，光鏡下觀察瘤組織的形態(tài)學(xué)改變，TUNEL法檢測移植瘤組織細(xì)胞的凋亡率，免

9、疫組化法檢測移植瘤組織內(nèi)PCNA的表達(dá)情況，通過移植瘤組織內(nèi)PCNA陽性細(xì)胞百分?jǐn)?shù)來判斷不同劑量HS-1200的抑瘤效果，應(yīng)用Western-blot檢測Bcl-2、Bax、cytochrome c、cleaved-caspase-3、pro-caspase-8、cleaved-caspase-9及Apaf-1的表達(dá)，進(jìn)一步探討HS-1200的抑瘤作用機(jī)制。 結(jié)果： 1、HS-1200 MTT檢測結(jié)果顯示鵝脫氧膽酸衍生物

10、HS-1200可有效地抑制肝腫瘤細(xì)胞株BEL7402的活性，其作用隨藥物濃度提高和作用時(shí)間延長而增強(qiáng)，呈現(xiàn)一定的劑量、時(shí)間依賴性：HS-1200 40μM作用于BEL7402細(xì)胞24h、48h、72h的生長抑制率分別為(29.25±0.54)％、(38.54±1.28)％、(50.29±1.81)％，HS-1200 80μM作用于BEL7402細(xì)胞24h、48h、72h的生長抑制率分別為(55.26±1.37)％、(62.49±1.42

11、)％、(71.34±2.04)％，同一細(xì)胞株不同濃度及不同時(shí)間之間的生長抑制率差異有顯著性(P＜0.05)。FCM凋亡檢測結(jié)果表明，BEL7402細(xì)胞經(jīng)HS-1200 40μM、60μM、80μM 3個(gè)濃度作用24h的凋亡率分別為(11.42±0.54.)％、(21.36±0.28)％、(42.25±0.52)％，對(duì)照組的凋亡率為(1.09±0.05)％；BEL7402細(xì)胞經(jīng)601μMHS-1200分別作用24h、48h、72h的凋亡率

12、分別為(21.36±0.28)％、(29.82±0.31)％、(37.15±0.45)％，隨作用濃度和作用時(shí)間的延長，凋亡率顯著增加，實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組之間及不同濃度組之間，有顯著性差異(P＜0.05)；Hoechst33258染色結(jié)果顯示細(xì)胞凋亡的形態(tài)學(xué)改變，凝膠電泳顯示典型的凋亡梯形條帶，Western blot檢測結(jié)果為HS-1200提升Bax、細(xì)胞色素C、PARP、cleaved-casepase-9及cleaved-caspase

13、-3的表達(dá)，而降低Bcl-2的蛋白表達(dá)水平，HS-1200能明顯降低肝腫瘤細(xì)胞的線粒體膜電位。 2、經(jīng)HS-1200治療的裸鼠肝移植瘤，觀察分離出的移植瘤的體積就可發(fā)現(xiàn)，治療組移植瘤體積明顯小于對(duì)照組移植瘤體積，并且在治療組中隨HS-1200濃度增高，腫瘤體積逐漸變??；根據(jù)腫瘤生長曲線可以發(fā)現(xiàn)，HS-1200治療后的腫瘤生長曲線不再表現(xiàn)為對(duì)照組的指數(shù)生長曲線，表現(xiàn)為增長緩慢，隨著濃度增高，其抑制作用逐漸增強(qiáng)，生長逐漸減慢；HE染

14、色后發(fā)現(xiàn)各組腫瘤組織內(nèi)均有不同程度的壞死，對(duì)照組多以輕度壞死為主，而治療組經(jīng)藥物治療后壞死面積均增加，大劑量組(60mg/kg)可見大片壞死組織，瘤細(xì)胞占切片的小部分；腫瘤組織的凋亡實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，各處理組隨著濃度增高，腫瘤組織中的凋亡細(xì)胞明顯增多，各組的凋亡指數(shù)分別為：對(duì)照組為(4.6±1.6)％；HS-1200(20mg/kg)組為(9.3±2.1)％；HS-1200(40mg/kg)組為(13.3±3.2)％；HS-1200(60m

15、g/kg)組為(17.5±4.3)％；各處理組同對(duì)照組比較P＜0.05：PCNA檢測結(jié)果為：對(duì)照組滿視野細(xì)胞核呈棕黃色的陽性腫瘤細(xì)胞，細(xì)胞形態(tài)極不規(guī)則，而HS-1200處理組則可見上述現(xiàn)象逐漸減少，并且視野中出現(xiàn)較多細(xì)胞核、細(xì)胞質(zhì)均為淡藍(lán)色的細(xì)胞。尤其HS-1200(60mg/kg)高劑量組，滿視野細(xì)胞核、細(xì)胞質(zhì)均為淡藍(lán)色，細(xì)胞形態(tài)較為規(guī)則，HS-1200(60mg/kg)高劑量組的陽性細(xì)胞百分?jǐn)?shù)為：(9.7±1.5)％；HS-1200

16、(40mg/kg)中劑量組陽性細(xì)胞百分?jǐn)?shù)： (14.7±2.0)％；HS-1200(20mg/kg)低劑量組陽性細(xì)胞百分?jǐn)?shù)：(18.9±2.7)％；對(duì)照組陽性細(xì)胞百分?jǐn)?shù)： (22.5±3.6)％；Western blot檢測結(jié)果為HS-1200提升Bax、細(xì)胞色素C、Apaf-1、cleaved-casepase-9及cleaved-caspase-3的表達(dá)，降低Bcl-2的蛋白表達(dá)水平。 結(jié)論： 1.鵝脫氧膽酸衍生物H

17、S-1200對(duì)人肝腫瘤細(xì)胞株BEL7402有顯著的生長抑制作用，該生長抑制作用與HS-1200誘導(dǎo)肝腫瘤細(xì)胞凋亡有關(guān)；HS-1200對(duì)正常肝細(xì)胞株無生長抑制及誘導(dǎo)凋亡的作用。 2.HS-1200誘導(dǎo)凋亡的機(jī)制可能與HS-1200降低肝腫瘤細(xì)胞的線粒體膜電位及提升Bax而降低Bcl-2的表達(dá)，從而使線粒體膜通透性增高，使細(xì)胞色素C由線粒體釋放入胞漿，活化caspase-9，活化的caspase-9切割pro-caspase-3生成

18、活性caspase-3，從而誘導(dǎo)凋亡；但上述凋亡過程中caspase-8特異性抑制劑未改變HS-1200誘導(dǎo)的凋亡，因而HS-1200誘導(dǎo)肝腫瘤細(xì)胞凋亡途徑為內(nèi)源性凋亡途徑。 3.采用人肝腫瘤細(xì)胞株BEL7402建立的裸鼠人肝移植瘤模型，用HS-1200進(jìn)行治療后可抑制裸鼠肝移植瘤的生長，引起瘤組織內(nèi)腫瘤細(xì)胞的凋亡和組織壞死。HS-1200抑瘤作用與其誘導(dǎo)肝腫瘤細(xì)胞凋亡有關(guān)，凋亡途徑亦為內(nèi)源性凋亡途徑。 4.鵝脫氧膽酸衍