1型多聚ADP核糖合成酶調(diào)節(jié)心血管系統(tǒng)相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄的機(jī)制研究.pdf

1、心肌細(xì)胞,心肌成纖維細(xì)胞,平滑肌細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞等心血管系統(tǒng)相關(guān)細(xì)胞在心肌缺血/再灌注損傷,各種原因引起的心力衰竭,心肌疾病,休克,心血管衰老,心肌肥大,動(dòng)脈粥樣硬化以及血管損傷重塑等病理過(guò)程中會(huì)產(chǎn)生過(guò)量的活性氧族和活性氮族分子,被稱為氧化應(yīng)激。這些活性氧/氮族分子在適量的情況下可作為信號(hào)分子參與細(xì)胞的正常生理過(guò)程。但過(guò)量的活性氧/氮族分子卻一方面可直接引起細(xì)胞功能障礙,另一方面通過(guò)激活其下游信號(hào)通路相關(guān)分子而影響細(xì)胞內(nèi)基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控

2、進(jìn)而影響蛋白質(zhì)表達(dá)異常。蛋白質(zhì)的異常表達(dá)是諸多心血管疾病發(fā)生發(fā)展乃至惡化的分子基礎(chǔ)。而尋找氧化應(yīng)激下游相關(guān)信號(hào)通路分子作為干預(yù)靶點(diǎn)將為心血管疾病的治療提供新的途徑。
　　在真核細(xì)胞內(nèi)普遍存在一類對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行多聚ADP核糖化修飾的蛋白酶類家族。其中含量最為豐富的是1型多聚ADP核糖合成酶(poly(ADP-ribose) polymerase1,PARP-1),分子量約為113-116KDa,約占細(xì)胞內(nèi)PARP酶活性的90％。PAR

3、P-1作為DNA損傷的感應(yīng)器和信號(hào)分子,當(dāng)它與斷裂的DNA結(jié)合后,酶的活性被激活,進(jìn)而以NAD+作為催化底物,轉(zhuǎn)移其ADP核糖到受體蛋白(如組蛋白,轉(zhuǎn)錄因子和PARP-1自身等)。而被修飾的受體蛋白會(huì)發(fā)生結(jié)構(gòu)和功能的改變。近年的研究發(fā)現(xiàn)PARP-1通過(guò)調(diào)控多種基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控在多種心血管疾病過(guò)程中發(fā)揮著重要的作用。在這些疾病的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中,PARP-1催化活性明顯增強(qiáng),而在大量的心血管疾病動(dòng)物模型中,給予PARP抑制劑處理后,可以發(fā)現(xiàn)P

4、ARP抑制劑發(fā)揮了明顯的積極有效的作用。本項(xiàng)研究將對(duì)PARP-1調(diào)節(jié)心血管相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)制和PARP-1抑制劑的干預(yù)效果進(jìn)行探討,并為PARP抑制劑的臨床研究提供理論和試驗(yàn)依據(jù)。
　　第一部分PARP-1在人外周血單個(gè)核細(xì)胞中介導(dǎo)HSP70的表達(dá)的機(jī)制研究
　　目的:探討1型多聚ADP核糖合成酶(poly(ADP-ribose) polymerase-1,PARP-1)對(duì)炎性刺激物脂多糖(lipopolysacchar

5、ide,LPS)誘導(dǎo)人外周血單個(gè)核細(xì)胞熱休克蛋白70(HSP70)表達(dá)的調(diào)節(jié)作用及其機(jī)制
　　方法及結(jié)果:1.對(duì)培養(yǎng)的正常人外周血單個(gè)核細(xì)胞分別給予LPS刺激后,采用酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)測(cè)定培養(yǎng)上清中HSP70的表達(dá)水平。使用PARP-1抑制劑3-氨基苯甲酰胺(3-aminobenzamide,3AB)預(yù)處理細(xì)胞后,觀察3AB對(duì)LPS誘導(dǎo)的HSP70表達(dá)的影響。經(jīng)LPS刺激后,HSP70的表達(dá)在不同時(shí)間點(diǎn)均顯著增高,與單純

6、LPS刺激組相比,PARP抑制劑3AB預(yù)處理細(xì)胞后HSP70的表達(dá)從18h開(kāi)始逐漸降低,在24h和48h均顯著低于LPS刺激組2.提取培養(yǎng)細(xì)胞核蛋白,采用PARP活性檢測(cè)試劑盒測(cè)定培養(yǎng)細(xì)胞內(nèi)PARP酶活性的變化。3AB顯著抑制了LPS刺激所致的PARP酶活性的增高。3.提取培養(yǎng)細(xì)胞核蛋白,采用凝膠遷移實(shí)驗(yàn)(Electrophoretic Mobility Shift Assay,EMSA)檢測(cè)核內(nèi)轉(zhuǎn)錄因子熱休克因子(heat shock

7、 factor-1,HSF-1)的DNA結(jié)合能力,并觀察PARP-1抑制劑對(duì)HSF-1的DNA結(jié)合能力的影響。LPS刺激細(xì)胞后,HSF-1的DNA結(jié)合能力顯著增高;3AB預(yù)處理細(xì)胞后HSF的DNA結(jié)合能力明顯減弱。4.應(yīng)用South-western技術(shù)檢測(cè)PARP-1重組蛋白與HSF-1重組蛋白作用后對(duì)后者DNA結(jié)合能力的影響。HSF-1重組蛋白在與PARP-1重組蛋白相互作用后,DNA結(jié)合能力明顯增強(qiáng)。5.應(yīng)用Far-western技

8、術(shù)分別檢測(cè)PARP-1重組蛋白與HSF-1重組蛋白及細(xì)胞抽提物中HSF-1之間的相互作用。PARP-1重組蛋白能與HSF-1重組蛋白及細(xì)胞抽提物中HSF-1結(jié)合。
　　結(jié)論:在LPS誘導(dǎo)人外周血單個(gè)核細(xì)胞產(chǎn)生HSP70的過(guò)程中,PARP-1活性明顯增高。激活的PARP-1通過(guò)調(diào)節(jié)HSF的DNA結(jié)合能力調(diào)控了HSP70的表達(dá)。
　　第二部分 PARP-1在大鼠平滑肌細(xì)胞中參與調(diào)節(jié)TGFβ/Smad3信號(hào)通路的機(jī)制研究
　

9、　目的:探討大鼠平滑肌細(xì)胞中1型多聚ADP核糖合成酶(poly(ADP-ribose) polymerase-1,PARP-1)對(duì)TGF-β信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中Smad3通路的作用。
　　方法及結(jié)果:在大鼠血管平滑肌細(xì)胞中,給予TGF-β1處理細(xì)胞后能通過(guò)誘導(dǎo)ROS的生成激活PARP-1。給以PARP抑制劑,3AB(3-aminobenzamide)或PJ34(N-(6-oxo-5,6-dihydrophenanthridin-2-yl

10、)-2-(N,N-dimethylamino)acetami),或者應(yīng)用PARP-1 siRNA沉默PARP-1能抑制TGF-β1介導(dǎo)的Smad3的磷酸化和核聚集。在給予TGF-β1處理后,通過(guò)激活細(xì)胞核中PARP-1而促進(jìn)Smad3的多聚ADP核糖化。對(duì)Smad3的多聚ADP核糖化修飾能增加Smad3-SBE復(fù)合物的形成,同時(shí)也增加Smad3的DNA結(jié)合能力。用3AB、PJ34或者PARP-1 siRNA預(yù)處理細(xì)胞后,能阻止TGF-β