殼寡糖-硬脂酸嫁接物納米顆粒對人單核細(xì)胞損傷作用研究.pdf

1、目的：
　　 納米技術(shù)是一門新興的技術(shù)，它已廣泛應(yīng)用于生產(chǎn)、生活的各個(gè)領(lǐng)域，如新藥開發(fā)、生物標(biāo)志物發(fā)現(xiàn)和分子診斷技術(shù)等。隨著納米技術(shù)的迅速發(fā)展及納米材料的大量增多，納米技術(shù)的安全性問題正引起世界范圍的重點(diǎn)關(guān)注。近年來研究發(fā)現(xiàn)不同途徑接觸的納米材料都可以進(jìn)入血液循環(huán)，可能對血細(xì)胞及凝血功能產(chǎn)生影響，因此納米材料對血液系統(tǒng)的潛在毒性也深受關(guān)注。
　　 聚合物膠團(tuán)是近幾年正在發(fā)展的一類新型納米藥物載體，具有增溶、靶向、長循環(huán)等

2、優(yōu)點(diǎn)。殼寡糖-硬脂酸嫁接物膠團(tuán)(納米顆粒，CSO-SA)是本校藥學(xué)院正在研發(fā)的納米載體，期望能夠作為抗腫瘤藥等藥物的載體而優(yōu)化給藥系統(tǒng)。這就使得該納米顆粒可能被直接注射入血，與血細(xì)胞和血管內(nèi)皮接觸，因此對其血液系統(tǒng)毒性的評價(jià)至關(guān)重要。
　　 體內(nèi)體外研究發(fā)現(xiàn)多種納米顆?？梢哉T導(dǎo)活性氧簇(ROS)的過量生成和炎癥反應(yīng)，這可能是納米顆粒對心血管系統(tǒng)產(chǎn)生有害效應(yīng)的主要機(jī)制。本研究主要觀察了CSO-SA納米顆粒對體外培養(yǎng)的人單核細(xì)胞的損

3、傷情況及氧化損傷機(jī)制。
　　 方法：
　　 1.細(xì)胞毒性檢測
　　 用倒置顯微鏡觀察CSO-SA(0、10、20、50、100、200、400、800μg/ml)處理24h后THP-1細(xì)胞形態(tài)變化；用透射電鏡觀察20μg/mlCSO-SA處理0、6、12、24h后THP-1超微結(jié)構(gòu)改變。
　　 用PI染色法觀察CSO-SA(0、10、20、50、100、200、400、800μg/ml)處理24h后和20

4、、50μg/mlCSO-SA處理0、6、12、24h后THP-1的死亡情況。
　　 用改良MTT法(CCK-8)檢測CSO-SA(0、10、20、50、100、200μg/ml)處理24h后和20μg/mlCSO-SA處理0、6、12、24、36、48h后THP-1細(xì)胞的相對存活率。
　　 2.氧化還原狀態(tài)檢測
　　 CSO-SA(0、2，10、20μg/ml)處理細(xì)胞24h后，用DCFH-DA法檢測THP-1細(xì)

5、胞內(nèi)ROS水平的變化；用GriessReagent檢測THP-1細(xì)胞培養(yǎng)上清液中NO水平。
　　 CSO-SA(0、2、10、20μg/ml)處理細(xì)胞24h后，用黃嘌呤氧化酶法測定細(xì)胞內(nèi)和上清液中SOD活力，通過過氧化氫的消耗速度來測定CAT活力，通過還原型谷胱甘肽(GSH)的消耗量來測定GSH-PX的活力。
　　 3.炎癥因子檢測
　　 用酶聯(lián)免疫試劑盒(ELISA)檢測CSO-SA(0、2、10、20μg/m

6、l)處理24h后THP-1細(xì)胞培養(yǎng)上清液中炎癥因子TNF-α、IL-1β的變化。
　　 4.NAC預(yù)處理后的變化
　　 NAC500μM預(yù)處理THP-1細(xì)胞1h后，1)檢測CSO-SA(0、2μg/ml)處理24h后THP-1細(xì)胞中ROS水平，2)檢測CSO-SA(0、2μg/ml)處理24h后THP-1細(xì)胞培養(yǎng)上清液中TNF-α、IL-1β的水平；并檢測未用NAC預(yù)處理的上述劑量組中各指標(biāo)的水平，進(jìn)行比較。
　　

7、 5.所有結(jié)果采用SPSS統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析
　　 結(jié)果：
　　 1.細(xì)胞毒性
　　 對照組細(xì)胞生長狀態(tài)良好，細(xì)胞多呈圓形或卵圓形，單個(gè)、飽滿，懸浮生長，大小均一，10-800μg/ml染毒組出現(xiàn)不同程度的細(xì)胞形態(tài)改變，從50μg/ml染毒組起，死亡破碎的細(xì)胞明顯增多。透射電鏡顯示20μg/mlCSO-SA使細(xì)胞表面細(xì)長突起增多，胞內(nèi)空泡形成。
　　 0-200μg/mlCSO-SA作用下，THP-1細(xì)胞

8、存活率顯著下降，存在劑量-效應(yīng)關(guān)系；20μg/ml的CSO-SA作用下，隨著時(shí)間的推移，THP-1細(xì)胞存活率下降，存在時(shí)間-效應(yīng)關(guān)系。
　　 2.氧化還原狀態(tài)
　　 細(xì)胞內(nèi)ROS水平在2μg/ml組顯著升高，其它劑量組與對照組相比P>0.05；SOD、CAT、GSH-PX活性均有波動，但是趨勢不一致。
　　 3.炎癥因子檢測結(jié)果
　　 細(xì)胞培養(yǎng)上清液中的TNF-α和IL-1β的濃度在各劑量組均顯著升高，且

9、TNF-α在0-10μg/ml的濃度范圍內(nèi)存在良好的劑量-效應(yīng)關(guān)系。IL-1β在0-20μg/ml的濃度范圍內(nèi)存在良好的劑量-效應(yīng)關(guān)系。
　　 4.NAC預(yù)處理后結(jié)果
　　 經(jīng)500μM的NAC預(yù)處理1h后，0和20μg/mlCSO-SA處理的細(xì)胞與未經(jīng)NAC預(yù)處理的細(xì)胞相比：1)細(xì)胞中ROS水平顯著降低，2)細(xì)胞培養(yǎng)上清液中TNF-α和IL-1β的濃度均顯著降低。
　　 結(jié)論：
　　 CSO-SA納米顆