慢性乙肝中醫(yī)證侯機(jī)體免疫反應(yīng)狀態(tài)分析.pdf

1、目的:采用蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù),檢測(cè)健康志愿者與慢性乙型病毒性肝炎(簡(jiǎn)稱(chēng)慢性乙肝)濕熱中阻、肝郁脾虛、瘀血阻絡(luò)、肝腎陰虛及脾腎陽(yáng)虛五種中醫(yī)證候患者外周血漿中差異表達(dá)的蛋白質(zhì),分析這些差異表達(dá)的蛋白質(zhì)與機(jī)體免疫反應(yīng)狀態(tài)之間的關(guān)系,初步探索出慢性乙肝各中醫(yī)證候所處免疫反應(yīng)狀態(tài)之蛋白質(zhì)組學(xué)規(guī)律,為臨床辨治慢性乙肝提供可供參考的客觀(guān)依據(jù),也為進(jìn)一步探討慢性乙肝中醫(yī)證候的分子基礎(chǔ)提供線(xiàn)索。
　　 方法:依據(jù)《病毒性肝炎中醫(yī)辨證標(biāo)準(zhǔn)》,于2009

2、年10月-2010年9月期間,在瀘州醫(yī)學(xué)院附屬中醫(yī)醫(yī)院住院和門(mén)診的慢性乙肝患者中,收集典型的濕熱中阻證(Ⅱ)、肝郁脾虛證(Ⅲ)、脾腎陽(yáng)虛證(Ⅳ)、肝腎陰虛證(Ⅴ)、瘀血阻絡(luò)證(Ⅵ)及健康正常人(Ⅰ)共105例作為研究對(duì)象。首先每種證型取5例樣本,對(duì)其血漿蛋白進(jìn)行雙向凝膠電泳,切取標(biāo)準(zhǔn)化總灰度值(％Vol)相差達(dá)2倍以上,且在慢性乙肝五種中醫(yī)證候中均存在明顯規(guī)律性變化的差異表達(dá)蛋白點(diǎn)進(jìn)行質(zhì)譜分析,搜索SWISS—PROT數(shù)據(jù)庫(kù),鑒定出以上

3、差異表達(dá)的蛋白質(zhì)。在這些差異表達(dá)的蛋白質(zhì)中篩選出能反映機(jī)體免疫反應(yīng)狀態(tài)的蛋白質(zhì),擴(kuò)大樣本量,每種證型取20例,正常對(duì)照組取5例,應(yīng)用ELISA技術(shù)對(duì)以上差異表達(dá)蛋白進(jìn)行驗(yàn)證,分析這些差異表達(dá)的蛋白質(zhì)與機(jī)體免疫反應(yīng)狀態(tài)之間的關(guān)系,探索其中的蛋白質(zhì)組學(xué)規(guī)律。
　　 結(jié)果:(1)獲得了分辨率和重復(fù)性均較好的血漿蛋白雙向電泳銀染圖譜,初步建立起慢性乙肝肝郁脾虛、濕熱中阻、肝腎陰虛、脾腎陽(yáng)虛、瘀血阻絡(luò)證組及健康人對(duì)照組血漿蛋白質(zhì)組表達(dá)圖譜

4、。(2)通過(guò)對(duì)比分析健康人對(duì)照組、慢性乙肝病人濕熱中阻證組、肝郁脾虛證組、瘀血阻絡(luò)證組、肝腎陰虛證組及脾腎陽(yáng)虛證組的雙向電泳圖譜,在五種證候中均存在明顯規(guī)律性差異表達(dá)的蛋白點(diǎn)共有五個(gè),通過(guò)質(zhì)譜鑒定,確定為結(jié)合珠蛋白(HP)、免疫球蛋白J鏈(Ig-J)、視黃醇結(jié)合蛋白(RBP)、C-反應(yīng)蛋白(CRP)、玻連蛋白(VN)。(3)選取其中主要與肝臟功能狀況相關(guān)的視黃醇結(jié)合蛋白(RBP)、結(jié)合珠蛋白(HPT)以及主要與機(jī)體體液免疫功能相關(guān)的免疫

5、球蛋白J鏈(Ig-J)進(jìn)行ELISA法檢測(cè),發(fā)現(xiàn)在各證候組中,反應(yīng)肝臟功能狀況的蛋白質(zhì)——視黃醇結(jié)合蛋白(RBP)、結(jié)合珠蛋白(HPT)均較正常對(duì)照組降低(P<0.05)。其中,各證候組視黃醇結(jié)合蛋白(RBP)與正常對(duì)照組比較均降低,其降低順序(降低最多排前)為:Ⅵ>Ⅴ>Ⅳ>Ⅲ>Ⅱ,中醫(yī)證候組間比較Ⅳ與Ⅲ間有顯著性差異(P<0.05)；各證候組結(jié)合珠蛋白(HPT)與正常對(duì)照組比較均降低,但組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。在各證候組

6、中,反應(yīng)機(jī)體體液免疫反應(yīng)狀態(tài)的蛋白質(zhì)——免疫球蛋白J鏈(Ig-J)均較正常對(duì)照組升高,升高順序?yàn)?升高最多排前)Ⅵ>Ⅴ>Ⅳ>Ⅲ>Ⅱ,各中醫(yī)證候組與正常組比較均有顯著性差異(P<0.05),且中醫(yī)證候組間比較均有顯著性差異(P<0.05)。
　　 結(jié)論:1.初步建立慢性乙肝肝郁脾虛組、濕熱中阻組、肝腎陰虛組、脾腎陽(yáng)虛組、瘀血阻絡(luò)組及健康人對(duì)照組血漿蛋白質(zhì)組表達(dá)圖譜。2.慢性乙肝五種中醫(yī)證型患者與正常人比較存在多個(gè)蛋白質(zhì)表達(dá)差異,表

7、明慢性乙肝不同中醫(yī)證候患者存在多蛋白表達(dá)異常,此為中醫(yī)“證”本質(zhì)研究奠定了科學(xué)基礎(chǔ)。3.在慢性乙肝五種證型中,反映機(jī)體體液免疫狀態(tài)的免疫球蛋白J鏈相對(duì)于正常對(duì)照組均升高,其中以瘀血阻絡(luò)證組升高最為明顯,其次為肝腎陰虛證組、脾腎陽(yáng)證虛、肝郁脾虛證組,最低為濕熱中阻證組。提示慢性乙肝患者存在體液免疫功能紊亂,且不同證型之間免疫紊亂程度不同。其中,瘀血阻絡(luò)證組免疫紊亂最重,其次為肝腎陰虛證組、脾腎陽(yáng)證虛、肝郁脾虛證組,濕熱中阻證組免疫紊亂最輕

8、。4.在慢性乙肝五種證型中,反應(yīng)肝功能損害程度的視黃醇結(jié)合蛋白、結(jié)合珠蛋白與正常對(duì)照組比較均降低。其中,視黃醇結(jié)合蛋白以瘀血阻絡(luò)證組降低最明顯,其次為肝腎陰虛證組、脾腎陽(yáng)虛組、肝郁脾虛證組,濕熱中阻證組最高。說(shuō)明慢性乙肝各中醫(yī)證型患者均存在不同程度的肝功能損害,其中,以瘀血阻絡(luò)證肝功能損害最為嚴(yán)重,濕熱中阻證相對(duì)最輕。5.在慢性乙肝五種中醫(yī)證候中,肝功能損害程度與機(jī)體免疫功能紊亂之間存在正相關(guān)性,即免疫功能紊亂程度越重,其肝功能損害程度